猫泛白细胞减少症病毒VP2基因遗传进化及其重组蛋白免疫原性研究

论文摘要

猫泛白细胞减少症是由猫泛白细胞减少症病毒（FPV）引起的一种急性高度接触性传染病。在自然状态下,FPV能感染几乎所有的猫科、鼬科及浣熊科动物,引起猫、水貂、浣熊等动物很高的死亡率,对野生动物和特种经济动物构成极大的威胁。目前,控制该病的主要手段是进行免疫接种。为了有效地控制该病在我国大型野生猫科动物中的发生和流行,迫切需要掌握FPV在虎群中的感染和流行毒株的遗传变异情况,积极研制安全有效的新型疫苗。本研究利用微量血凝抑制试验首次对我国东北某野生动物园的圈养虎进行了血清FPV HI抗体调查,并对近年来从我国不同地区收集的疑似FPV感染的虎粪便进行了PCR检测和病毒的分离鉴定,同时对分离的FPV毒株VP2基因进行了克隆、测序和遗传进化分析。在此基础上,开展了FPV GT-2株VP2主要抗原蛋白基因在毕赤酵母中的表达和以犬2型腺病毒（CAV-2）为载体的VP2重组病毒的构建及家猫实验免疫研究。结果,在调查的184份虎血清中FPV HI抗体阳性率为49.5%,表明FPV在此虎群中感染十分普遍。对24份疑似FPV感染的虎粪便样品进行的PCR检测结果显示9份阳性。用F81传代细胞从9份PCR检测阳性粪便样品中成功分离获得了HT-69、GT-2、GT-3、JF-1、JF-3、ZF-5和SM-4等7株FPV。序列测定表明,7株FPV VP2基因全长均为1755个核苷酸,编码584个氨基酸,与FPV标准毒株CU-4 VP2基因大小相同。7个FPV分离株核苷酸序列的同源性为99.299.8%,氨基酸的同源性为98.199.8%。基于FPV VP2基因的系统发生分析表明,不同的FPV毒株可划分为两个基因群:第一群（基因I群）包括FPV d、CU-4等国外早期分离的毒株;第二群（基因II群）包括377和本实验室从虎中新近分离的7个毒株。国内7个FPV流行毒株VP2基因存在一定的变异现象,但大部分变异为同义突变,错义突变以散发的点突变为主。将FPV GT-2株VP2基因克隆到pPICZαA中,在毕赤酵母中实现了VP2蛋白的分泌性表达,用所表达的VP2重组蛋白免疫小鼠,证实其具有良好的免疫原性。以感染性CAV-2全基因组为载体,首次构建了含有FPV VP2基因的CAV-2-VP2重组病毒。

论文目录

• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 肉食兽细小病毒研究进展
• 第二章 猫泛白细胞减少症病毒研究进展
• 第二篇 研究内容
• 第一章 猫泛白细胞减少症虎源抗体调查及FPV 流行毒株VP2 基因遗传进化分析
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 2.1 虎血清FPV HI 抗体测定结果
• 2.2 虎粪便样品PCR 检测结果
• 2.3 病毒分离结果
• 2.4 病毒学鉴定结果
• 2.5 FPV 分离株VP2 全长基因的克隆与序列测定
• 2.6 7 个FPV 流行毒株VP2 基因及其推导的氨基酸序列分析结果
• 2.7 VP2 蛋白疏水性、抗原表位和表面极性预测分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 猫泛白细胞减少症病毒 VP2 蛋白基因在毕赤酵母中的表达及其免疫原性研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 2.1 VP2 基因的扩增与克隆
• 2.2 VP2 基因的序列测定
• 2.3 重组质粒pPICZαAVP2 的鉴定
• +表型重组酵母菌的筛选'>2.4 Mut⁺表型重组酵母菌的筛选
• 2.5 重组酵母菌的PCR 鉴定
• 2.6 VP2 目的基因在酵母菌中转录水平的检测
• 2.7 VP2 重组蛋白的SDS-PAGE 及Western blot 检测
• 2.8 VP2 重组蛋白在酵母培养液上清总蛋白中含量的测定
• 2.9 VP2 重组蛋白免疫小鼠试验结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 猫泛白细胞减少症病毒 VP2 基因重组犬2 型腺病毒的构建、鉴定及其免疫原性研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 2.1 重组质粒pVAXVP2 酶切鉴定结果
• 2.2 重组质粒pVAXVP2 转染MDCK 细胞后的间接荧光染色检测结果
• 2.3 重组质粒pVAXΔE3 酶切鉴定结果
• 2.4 重组质粒pVAXΔE3VP2 酶切鉴定结果
• 2.5 重组骨架质粒pCAV-2-FPV-VP2 酶切鉴定结果
• 2.6 CAV-2-VP2 重组病毒基因组转染MDCK 细胞结果
• 2.7 CAV-2-VP2 重组病毒的鉴定结果
• 2.8 CAV-2-VP2 重组病毒表达的VP2 蛋白及其检测结果
• 2.9 CAV-2-VP2 重组病毒免疫小鼠试验结果
• 2.10 CAV-2-VP2 重组病毒的遗传稳定性
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 猫泛白细胞减少症病毒 VP2 重组蛋白与 CAV-2-VP2 重组病毒实验免疫研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 2.1 免疫猫血清FPV ELISA 抗体的检测
• 2.2 免疫猫血清 FPV HI 抗体检测
• 2.3 免疫猫血清 CAV-2 HI 抗体检测
• 2.4 免疫猫血清 FPV SN 抗体检测
• 2.5 免疫猫脾淋巴细胞转化试验结果
• 2.6 攻毒试验结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 中文摘要
• 英文摘要
• 攻博期间发表的学术论文及其他成果
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介