肝细胞肝癌骨转移预测基因的研究及相关分子机制的探讨

论文摘要

目的：分析CTGF及IL-11在肝细胞癌（HCC）组织中mRNA的表达水平及与骨转移和生存之间的关系。方法：随机挑选并收集127例HCC石蜡包埋肿瘤组织,提取总RNA,定量PCR检测CTGF及IL-11表达情况。用Cox regression分析CTGF、IL-11以及临床病理因子与骨转移的关系。同时免疫组化半定量检测20例有骨转移和20例无骨转移HCC肿瘤组织中CTGF及IL-11的蛋白表达。结果：127例HCC患者中骨转移患者16例（12.6%）,CTGF在所有标本中均有表达,骨转移患者中的平均表达量是非转移组中的3.63倍。而IL-11在骨转移组中阳性率为62.5%（10/16）,而非转移组为18.9%（21/111）。多因素分析表明CTGF（p=0.010）、IL-11（p=0.031）、TNM分期（p=0.005）、血管侵犯（p=0.027）以及肿瘤分化（p=0.043）是HCC骨转移独立危险因素。CTGF及IL-11蛋白表达与mRNA致,骨转移组均明显强于未转移组.（p<0.05）。结论:CTGF及IL-11在HCC原发肿瘤组织中高表达是HCC骨转移的独立危险因素,联合应用TNM分期、肿瘤分化以及血管侵犯等临床病理指标可预测HCC骨转移的发生。目的：CTGF及IL-11临床标本研究证实其RNA表达水平与HCC骨转移密切相关,本研究继续分析CTGF及IL-11在不同HCC细胞系中的表达及其与肿瘤侵袭转移的关系,并对相关分子机制进一步探讨。方法：PCR、western检测不同人HCC细胞系中CTGF及IL-1表达情况；重组细胞因子体外刺激,研究其对HCC细胞增殖迁移的影响；采用siRNA技术沉默HCC细胞97H中CTGF及IL-11基因,检测细胞增殖侵袭性的改变,并检测相关信号通路的变化。结果：CTGF及IL-11在不同肝细胞系中均有表达,其中高转移潜能细胞系（MHCC97L, MHCC97H, MHCCLM3）中CTGF及IL-11均高表达,而低转移潜能肝癌细胞系（Huh7和7721）均低表达；重组细胞因子rhCTGF及rhIL-11体外刺激并不影响细胞增殖,但却显著性地增加了HCC细胞的迁移能力；CTGF及IL-11基因下调后明显抑制了其侵袭迁移能力,CTGF下调引起Akt磷酸化的减少,rhCTGF促进了NF-κB核转录活性;rhIL-11提高了磷酸化STAT3的表达水平。结论：CTGF及IL-11在HCC细胞系中的表达与其侵袭迁移能力密切相关,CTGF及IL-11的高表达通过不同的信号通路,引起HCC形态学的改变,增强了HCC细胞的生长优势,最终造成了转移潜能的提高,引起肿瘤的转移。目的：肿瘤缺氧可以促进肿瘤的生长和转移,并影响肿瘤的生物学行为及治疗应答,CTGF及IL-11表达与HCC侵袭转移相关,本部分研究肿瘤缺氧与CTGF及IL-11之间的关系。方法：HCC细胞97L体外缺氧培养,分别收集不同时间点RNA及上清培养液,PCR检测CTGF、HIF1α、VEGF、OPG等细胞因子变化情况,同时检测上清液中CTGF、 VEGF、MMP-2、MMP-9及OPG的改变。rhCTGF及rhIL-11体外刺激观察其在缺氧条件下对相关基因的影响；采用siRNA技术沉默HCC细胞97H中CTGF基因,基因下调后缺氧下相关基因的变化。结果：缺氧增加了HCC细胞97L中CTGF的表达,这种升高是瞬时性的,在1.5h达到最高为基础值的2.8倍。HIF-1α缺氧后在12h达到最高点,rhCTGF处理更为显著地诱导了HIF-1α的表达。缺氧也可诱导OPG、MMP-2、MMP-9的分泌,CTGF siRNA抑制了HIF-1α的核转录和VEGF的产生。结论：肿瘤缺氧诱导了CTGF的表达,而CTGF的表达启动了肿瘤血管生成的级联反应,并提高了缺氧相关基因的表达。HCC细胞缺氧下释放OPG赋予了HCC细胞生存优势,逃逸了免疫系统的监视。这种缺氧诱导的级联反应在多个基因介导下最终诱导了HCC患者体内的骨转移。目的：肿瘤细胞和间质细胞相互作用对肿瘤的发生发展至关重要。活化的星状细胞参与了肝纤维化及HCC的进展。我们猜想破坏星状细胞和HCC的相互作用可增加药物的敏感性。因此本部分体外研究肝星状细胞和HCC细胞的相互作用。方法：分别检测HCC细胞系Huh7及97L中CXCR4的表达情况,并收集人星状细胞系LX-2及HCC细胞培养上清液,建立HCC及LX2细胞共培养系统,transwell研究LX-2细胞对HCC的趋化作用,并研究CXCR4特异性抑制剂AMD3100对这种相互作用的影响。TUNEL检测索拉菲尼联合AMD3100对HCC细胞凋亡的影响结果：CXCR4在HCC细胞中均有表达,LX-2上清液共培养可诱导HCC中CXCR4的核浆易位。HCC细胞可以活化星状细胞,而LX-2细胞可以促进HCC的增殖及迁移。索拉菲尼在LX-2存在的情况下对HCC迁移能力的抑制明显减弱,LX-2诱导显著性的凋亡抵抗,联合应用AMD3100可破坏这种相互作用,恢复索拉菲尼的治疗敏感性。结论：HCC细胞促进了星状细胞的活化,而活化的星状细胞又促进了HCC的进展。AMD3100破坏了这种相互作用,提高了索拉菲尼的敏感性,降低了肿瘤侵袭转移潜能。

论文目录

• 前言
• 参考文献
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 CTGF及IL-11在肝细胞肝癌组织中的表达及与骨转移的相关性分析
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 CTGF及IL-11在人肝细胞肝癌细胞系中的表达及功能分析
• 前言
• 第一节 CTGF及IL-11在不同肝癌细胞系中的表达
• 材料方法
• 结果
• 第二节 CTGF及IL-11重组细胞因子对HCC细胞功能的影响
• 材料与方法
• 结果
• 第三节 CTGF及IL-11基因沉默对HCC功能影响及机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 CTGF、IL-11与肿瘤缺氧及肝细胞肝癌骨转移的相关性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 CXCR4抑制剂AMD3100抑制肝细胞肝癌细胞与肝星状细胞相互作用的体外研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述 肿瘤骨转移转移路径的研究进展
• 参考文献
• 附件
• 致谢