论文摘要
慢性肝炎、肝硬化以及与此相关的肝癌是严重危害健康的一系列疾病,在我国的发病率尤其高。在上述疾病状态下,对肝功能的准确评估不仅对肝脏围手术期具重大意义,也是指导治疗和评价预后的有效依据。从Child－Pugh分级到血液检测肝脏清除或负荷试验等,目前常用的检测手段所评价的结果往往反映了术前的全肝功能,而对切除部分或剩余肝的功能在术前通常无法预估。近来的三维显像技术,如单光子发射型计算机断层显像（single photon emission computed tomography,SPECT）和正电子发射型计算机断层扫描显像一计算机断层扫描显像（PositronEmission Tomography－Computed Tomography,PET-CT）的发展为这种术前肝区段功能的评估带来可能。这样,能显示肝功能的肝脏显像剂成为了关键因素。在我们的前期研究中,应用了代表胆汁代谢的锝—99m标记的二乙基乙酰苯胺亚氨二醋酸(99mTc－EHIDA)作为肝脏显像剂,结合SPECT核素显像技术在动物和临床上作了探索。将肝脏划分为多个体素构成,任意部分肝脏包含的所有体素的放射性计数之和,与整体肝脏体素计数的比例,就代表了这部分肝脏的功能与整体肝功能的关系。从而在任意设定手术切线的情况下,均可计算出手术后剩余肝脏功能,这项工作目前在国内尚无类似报道。但是EHIDA作为肝功能显像剂,存在着一些缺陷,如它通过胆道代谢,其显像效果受到胆道疾病的影响;其次,肝脏对EHIDA的摄取、代谢以及排泄过程往往同时进行,这样就不能像理论上那样完全代表肝细胞的功能;而且由于EHIDA在肝脏的代谢速度较快,在静脉注射30分钟后其在肝脏的浓聚程度呈明显下降趋势,导致后期的显像效果不佳。故我们寻找了与肝功能更加相关的肝脏显像剂来替代EHIDA。Kokudo等发现在肝炎、肝硬化或肝癌等肝损伤性疾病发生时,哺乳动物肝细胞膜上的血浆去唾液酸糖蛋白受体（Asialoglycoprotein receptor,ASGPR）的数量和活性均受到损害,利用这种现象,日本学者曾合成去唾液酸糖蛋白（asialoglycoprotein,ASGP）类似物—GSA（diethylenetriamine pentaaceticacid-galactosyl-human serum albumin）,并开展临床成像技术。由于此技术在欧洲、美国及国内均无报道,我们自行合成了GSA及其一步法冻干药盒（专利申请号:200810057222.1）,并通过99mTc标记来进行肝功能的显像研究。测定其在正常小鼠以及肝纤维化、肝淤胆和肝癌这三种不同类型肝细胞损伤的小鼠模型中的摄取和生物分布情况,验证其生物有效性。然后在正常新西兰兔上应用,并进行SPECT三维扫描显像,确定其显像功效及生物代谢。之后我们已首先将其应用于临床,观察其有效性,并进一步结合计算机程序用其评估任意区段肝功能,最终有望完成肝脏切除手术风险的数字化表现形式。第一部分99mTc-GSA的制备及其药盒化研究目的为了对肝硬化患者术前肝功能进行正确的评估,帮助预测手术风险、制定治疗方案,降低肝脏手术的围手术期死亡率,我们制备了ASGPR显像剂:99mTc-GSA。为方便该药物的临床研究以及应用推广,进一步研制了无菌的GSA一步法冻干药盒。并在正常小鼠中对99mTc-GSA进行了生物评价。方法通过DTPA环酐,将双功能连接剂引入人血白蛋白（HSA）分子,再通过合成2-亚氨基-2-甲氧基乙基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷,与DTPA-HSA反应,引入硫代半乳糖残基,得到GSA。以氯化亚锡为还原剂,通过标记条件的摸索,寻找最佳标记条件。在此基础上,进一步研制无菌的GSA一步法冻干药盒,并对湿法以及冻干法制备的该标记配合物进行了比较。最后在正常小鼠中进行了生物分布实验。结果制定方法并合成了2-亚氨基-2-甲氧基乙基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷,其化学合成产率较高,中间产物均经过红外、核磁、元素分析的鉴定。所得GSA通过苯酚.硫酸法测其糖密度为31,符合文献中报道的药盒中GSA糖密度（30-40）范围。通过标记条件的摸索,找到的最佳标记条件为:GSA 3mg,SnCl2·2H2O 20μg,反应时间30min。最终确定一步法冻干药盒的配方为:GSA 3.0mg,SnCl2·2H2O 20μg,pH值3.5和赋形剂适量。在正常小鼠中的分布试验表明,99mTc-GSA在正常小鼠肝脏中有很高的摄取,在30min时,肝脏摄取仍大于70%ID·g-1,且具有饱和性。结论肝细胞受体显像剂的合成为通过核医学SPECT等显像技术来三维评估肝功能打下了基础,人工合成的GSA是血浆去唾液酸糖蛋白的类似物,能与肝细胞表面的特异性受体相结合,不但能够评价肝脏的形态和功能,为肝脏手术提供参数,而且对研究体内物质代谢、肝脏的生理学和病生理学也有重要价值。日本学者已利用其开展临床成像技术,而在欧美及国内却无相关报道。基于以上考虑,我们成功制备了ASGPR显像剂:99mTc-GSA,并通过标记条件的摸索制备了标记率大于96%的标记配合物99mTc-GSA,进一步研制了无菌的GSA一步法冻干药盒（专利申请号:200810057222.1）。在正常小鼠中的分布试验表明,99mTc-GSA能被小鼠肝脏特异性地摄取,显像时间长于半个小时。说明所得GSA一步法冻干药盒标记简单可靠,有优良的生物性能,可提供临床进一步研究、应用。总结本研究在国内首先合成了99mTc-GSA及其冻干药盒,在进一步的动物模型验证其生物效应后,可以用于肝硬化肝癌的研究以及三维立体评价剩余肝功能的实验研究。第二部分99mTc-GSA在不同小鼠肝损伤模型中的应用目的自行合成的新型肝显像剂99mTc-GSA能根据浓聚情况显示肝脏功能,本研究的目的是明确99mTc-GSA在三种不同类型肝细胞损伤的小鼠模型中不同的摄取和生物分布情况。方法将昆明小鼠随机分为三个模型组与一个正常对照组。三种小鼠模型分别为肝纤维化、肝淤胆和肝癌模型。前者用腹腔内注射四氯化碳完成（每48h腹腔注射0.4ml 10%CCl4,共48天）;淤胆性肝损伤模型以结扎胆总管72小时建立;肝肿瘤模型用H22肿瘤细胞株种植肝包膜下10天建立。对照组陪同饲养。各模型组小鼠与正常对照组小鼠均以0.1 mL（0.37MBq） 99mTc-GSA（2μg）注射尾静脉,5min后断头处死,取出各重要器官（肝、心、肺、肾、脾、胃、血、骨、肉、肠）称量,测其放射性计数,并计算之间的差异。用血清学及肝脏病理学检查验证肝脏损伤。结果在三个模型组和对照组中,99mTc-GSA在小鼠肝脏均有显著浓聚（%ID/g>40）,但与对照组（%ID/g=90.05±10.55）相比,其它肝损伤模型组的浓聚度有显著下降（P<0.001）。在三个模型组中,损伤较轻的肝纤维化模型的浓聚度（%ID/g=72.20±2.1 3）比损伤较重的淤胆模型和肿瘤模型要显著地高（%ID/g=56.72±5.92,42.80±6.05）（P<0.001,P<0.001）。结论自行合成的99mTc-GSA在肝脏有显著的浓聚,其浓聚程度与肝功能受损害情况呈负相关,它可能成为临床上能反映肝功能的显像剂,如同三维扫描技术结合,有希望建立肝脏区段功能的三维成像系统。总结本研究将自行合成的99mTc-GSA应用于三个不同类型的小鼠肝损伤模型,验证了99mTc-GSA的生物有效性,在进一步确定其安全性的前提下,有助于将该药盒技术推应用于临床。第三部分99mTc-GSA的临床前动物显像研究目的在验证了自制99mTc-GSA的生物有效性的基础上,在临床应用前进一步证明其能在SPECT技术上使肝脏明确显影,并观察其在生物体内的代谢过程。方法取新西兰兔7只,麻醉后仰卧固定于兔板。经耳缘静脉推注O.1 mL（约0.37MBq）药盒法标记的99mTc-GSA（0.1mg/Kg）,应用SPECT仪,探头置于心脏上方,即刻开始采集心脏动态数据,2s/帧,采集1分钟;然后分别在5min、10min、20min、30min、60min、120min时进行全身的数据采集;在30min时采集完全身后即刻进行肝脏的断层采集,探头围绕肝脏旋转180°,每6°采集一帧,30s/帧。结果通过新西兰兔心区的时间一放射性曲线发现,99mTc-GSA在心脏迅速排出,1min时心脏的ID%仅为7.96%。全身数据采集表明,在30min内,99mTc-GSA在肝脏的ID%能在50%以上,并能较好地进行肝脏的动态三维显像。除了肝脏以外,99mTc-GSA的主要浓聚器官为膀胱与胃肠,浓聚程度与时间成正比。大脑基本无放射性浓聚。结论99mTc-GSA在进入生物体后,能立即被肝脏特异性地摄取,基本不累积在循环系统。它在肝脏的滞留时间大于30min,能较好地完成肝脏的三维显像。它的代谢途径主要是通过泌尿系统与消化系统,基本不通过血脑屏障。总结本研究证明了99mTc-GSA具有较好的肝脏显像功效,代谢途径安全,可以用于临床人体肝脏三维立体评价。第四部分99mTc-GSA的临床应用目的在完成了99mTc-GSA的先期合成与动物显像研究后,为了进一步将其推广于临床,我们在通过伦理委员会审批的前提下,将其应用于正常人体及肝占位患者,观察99mTc-GSA的显像情况,为其在临床上进行肝功能的三维立体评估奠定基础。方法取正常人4例,肝占位患者1例,经外周静脉推注99mTc-GSA 5mCi/1ml,进行SPECT数据动态采集、肝脏断层采集以及全身扫描。然后在动态采集图像上勾划肝感兴趣区（region of interest,ROI）,评估显像剂在肝脏浓聚情况,并利用SPECT技术进行三维成像。结果99mTc-GSA在肝脏形成明显浓聚,完整清晰地显示肝脏轮廓,并且在肝脏的滞留超过20分钟。在肝占位患者的断层及三维成像上呈现明显的冷区。结论临床实验表明99mTc-GSA能与肝细胞表面受体特异性地结合,形成明显的肝脏浓聚区,使肝脏清晰显像;在肝脏的滞留时间比较长,能较好地完成各项肝脏功能评估。占位组织不与显像剂结合,形成浓聚缺损的冷区。总结99mTc-GSA的小规模临床应用与预期显像结果一致,为临床上进行肝功能的三维立体评估并进一步建立肝脏可切除范围的风险评估体系奠定了基础。