绿色荧光蛋白的定点突变及新型T载体构建研究

论文摘要

TA克隆是最简洁、高效的克隆PCR产物的方法之一，在没有合适的酶切位点来进行载体间的DNA片段亚克隆时尤其有用。T载体具有3末端单一的T凸出尾，使其能够直接与3端具有A凸出尾的PCR产物高效连接。常用T载体的不足之处在于需要IPTG诱导和X-gal显色剂，例如蓝白斑筛选；或者菌株生长不稳定，如利用毒蛋白或杀菌肽构建的T载体。最近绿色荧光蛋白（GFP）被用于构架T载体的筛选试剂，插入片段和T载体的重组菌落可以在可见光下进行鉴定，但是仍然需要IPTG诱导。本实验使用一种新型GFP突变体Emerald作为细胞荧光指示剂，构建新型灵敏的T载体。主要结果如下：1、定点突变：定点突变绿色荧光蛋白突变体EGFP（F64L–S65T–H231L），获得4个氨基酸残基突变的Emerald突变体（S72A, N149K, M153T和I167T）。2、胞外分析：构建大肠杆菌Emerald的表达载体p28SUMO-emerald。表达并纯化重组蛋白Emerald，并分析其紫外可见光谱和荧光扫描光谱性质与报道一致。重组Emerald在Hampton Screen Ⅰ&Ⅱ的第39号条件：2mol/L（NH4）2SO4，0.1mol/LHEPES-NaOH, pH7.5,2%PEG400中晶体生长最优，为柱状晶型。3、胞内分析：Emerald基因连入pUC18载体后，上游添加增强子以增强表达效果，在不加IPTG和X-gal的条件下，37℃培养18小时，大肠杆菌重组菌落在可见光下显示绿色。添加增强子后，菌液每毫克上清总蛋白荧光强度提高至原来的3.3倍。4、同义突变：根据GFP的三维结构预测结果，分别在Emerald突变体第4和第5个β折叠片层结构上选择了2个突变位点，即第93位的V和第109位的R，分别创建SnaBⅠ和SmaⅠ酶切序列。5、T载体构建及验证：构建pESN-T和pESM-T载体。将约500bp外源PCR片段分别与两种T载体连接，重组菌斑为白色，对照在可见光下为绿色。6、插入突变：为了验证T载体的灵敏性，利用定点突变的方法分别在pESN和pESM载体的SnaBⅠ和SmaⅠ酶切位点识别序列中间添加一个三核苷酸序列TCC。平板转化以及菌液上清总蛋白荧光强度分析显示绿色荧光消失，插入突变后的Emerald蛋白在包涵体中表达，折叠性和表达量均受到大幅度影响。综上所述，本文研究了绿色荧光蛋白突变体Emerald在大肠杆菌胞外和胞内性质，选取两个限制性内切酶位点SnaBⅠ和SmaⅠ作为插入位点构建T载体，并构建插入一个三核苷酸序列TCC的突变载体，转化后菌落荧光强度几乎为零，蛋白表达量以及折叠性均大幅度下降。本研究构建的T载体目前最灵敏，具有良好的应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 TA 克隆
• 1.2 常用 T 载体的制备方法
• 1.2.1 平末端加 T 法
• 1.2.2 脱氧核苷酸末端转移酶（TDT）法
• 1.2.3 限制性内切酶法
• 1.2.4 PCR 法构建 T 载体
• 1.3 已报道 T 载体的筛选方法
• 1.3.1 蓝白斑筛选
• 1.3.2 利用毒蛋白或杀菌肽的筛选方法
• 1.3.3 利用红色荧光蛋白的筛选方法
• 1.3.4 利用绿色荧光蛋白的筛选方法
• 1.4 常见荧光蛋白及其种类
• 1.4.1 绿色荧光蛋白及其突变体
• 1.4.2 红色荧光蛋白及其突变体
• 2 引言
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 研究内容
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株、质粒
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器和设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 绿色荧光蛋白突变体 Emerald 基因的获得
• 3.2.2 Emerald 在大肠杆菌表达系统的胞外光谱性质和晶体生长
• 3.2.3 Emerald 在大肠杆菌系统中的胞内荧光性质
• 3.2.4 利用 Emerald 作为筛选试剂的 T 载体的构建
• 3.2.5 成熟 T 载体的克隆功能验证
• 3.2.6 成熟 T 载体的对插入失活的灵敏程度验证
• 4 结果与分析
• 4.1 绿色荧光蛋白突变体 EMERALD 基因和 PUC18 线性载体片段的扩增
• 4.2 EMERALD 在大肠杆菌表达系统的胞外光谱性质和晶体生长
• 4.2.1 原核表达载体 p28SUMO-emerald 的构建
• 4.2.2 重组蛋白 SUMO-GFP 的表达与纯化
• 4.2.3 绿色荧光蛋白 Emerald 的光谱扫描
• 4.2.4 绿色荧光蛋白 Emerald 的晶体生长
• 4.2.5 绿色荧光蛋白 Emerald 晶体结构预测
• 4.3 EMERALD 在大肠杆菌系统中的胞内荧光性质
• 4.3.1 pUC18E 载体的构建
• 4.3.2 Emerald 在大肠杆菌 DH5α菌株中渗透表达的表达量分析和荧光强度分析
• 4.4 利用 EMERALD 作为筛选试剂的 T 载体的构建
• 4.4.1 克隆载体 pESN 和 pESM 的构建
• 4.4.2 末端加 T 构建 pESN 和 pESM-T vector
• 4.5 成熟 T 载体的克隆功能验证
• 4.6 成熟 T 载体的对插入失活的灵敏程度验证
• 5 讨论
• 5.1 绿色荧光蛋白突变体 EMERALD 的大肠杆菌胞内外活性研究
• 5.2 基于绿色荧光蛋白 EMERALD 插入失活的 T 载体的构建及功能验证
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介