论文摘要
1实验目的中药复方配伍是中医用药的一大特色和优势,了解其配伍规律对临床辨证施治有重要的指导意义。中药复方多以口服形式入药,药物在肠道中的吸收是决定药物生物利用度和影响药物发挥治疗作用的关键因素。本研究以戊己丸为例,利用正交设计的方法,从肠吸收角度,通过监测中药复方组成中药的代表成份小檗碱（Ber）、巴马汀（Pal）、吴茱萸碱（Evo）、吴茱萸次碱（Rut）、芍药苷（Peo）,以其数、量、相互比例为着眼点,研究戊己丸不同比例的配伍肠道吸收过程中的动态变化规律,以及组成药物的贡献度、贡献形式等,并以数学方程和图解对其进行描述,借以探讨中药复方的配伍原理以及科学性。2实验方法和结果2.1戊己丸组方及其配伍的肠外翻吸收研究方法:采用L9（34）正交设计表,将戊己丸组方中的黄连、制吴茱萸、炒白芍作为3因素,各因素的3个不同剂量作为实验的水平数,研究戊己丸9个不同配比及其相应的单味药物在肠道中的吸收。采用肠外翻生物模型,以戊己丸中代表成份Ber、Pal、Evo、Rut、Peo为检测对象,用HPLC检测五个成分在单味药中的经时吸收量,用LC-MS同时检测戊己丸配伍中五个代表成份的变化。通过单因素方差分析（ANOVA）、正交设计的方差分析及归一化加权综合评分法对实验结果进行统计分析。结果:黄连提取物中Ber和Pal在肠道吸收过程中为零级吸收,其R2＞0.9,在不同剂量时Kα显示两者为被动扩散,各肠段吸收总趋势为空肠＞回肠＞结肠;制吴茱萸提取物中Evo和Rut在肠道中为零级吸收,R2＞0.9,Evo在小肠各段、Rut在空肠、回肠中均表现为主动转运,Rut在结肠中Kα随剂量增加而增加,表现为被动扩散形式,低剂量时结肠吸收少于空肠、回肠,高剂量时结肠多于空肠、回肠;Peo吸收为零级吸收,R2＞0.9,吸收形式以被动扩散为主,不同肠段的吸收为空肠＞回肠＞结肠。用LC-MS结合快速分离色谱柱,建立同时测定戊己丸中5个性质不同化合物的分析检测方法,实现了在较短时间内（t＜3.5min）同时分离目标检测成分;同时对方中5个化学成分均采用ESI正离子模式选择性离子检测法,排除了其他杂质的干扰,方法操作简单、快速、灵敏度高、特异性强、重现性好。正交设计研究显示戊己丸中5个代表成份在不同配伍比例时在肠道的吸收动力学不同。在空肠、回肠、结肠中5个代表成分的最佳吸收组合分别为,Ber（12:6:3、12:6:3、12:2:3）,Pal（12:1:12、12:1:12、12:2:12）,Evo（6:6:3、6:6:3、6:6:3）,Rut（12:6:12、12:6:3、12:6:3）,Peo（6:2:6、6:2:6、6:6:6）,相同成分在肠道不同部位的吸收趋势大致相同,但不同成分之间的吸收趋势变化较大。用多指标正交实验分析方法进行方剂配伍比例的优选,首先将分散的数据归一化,使其具有可比性。然后针对指标间的重要性差异给出各指标的权重,本实验依据戊己丸组方中的君臣佐使,确定Ber和Pal的权重为6,Evo、Rut和Peo的权重为4,给出综合评分进行正交统计。结果为黄连在各肠段吸收贡献度最大,确定了其君药地位,制吴茱萸和炒白芍次之,为臣药,其吸收最优配伍比例为黄连:制吴茱萸:炒白芍=6:3:6。2.2戊己丸单方及优选配伍组方在Caco-2细胞中的吸收研究方法:利用Caco-2细胞类似小肠上皮细胞的特性,研究中药提取物及其配伍在细胞中的摄取和转运特征。摄取实验将细胞种于24孔板,加药1h后细胞匀浆,测定细胞内药物含量;转运实验将细胞接种到Millicell小室膜上,待细胞具有极性、分化完成、完整性好后进行转运实验,实验时分别将药物加入AP或BL侧,检测另一端小室内的药物吸收/外排量的变化。结果:细胞生长21天碱性磷酸酶活力AP侧为BL侧的2倍以上（P＜0.05）,说明细胞具有极性,分化完成;荧光素钠Papp值在4.4×107cm·sec-1,2 h其透过率在0.7%,TEER值达到600Ω·cm2（7-8 d）,证明细胞完整性较好,可以用于转运实验。Caco-2细胞实验进一步证明了Ber、Pal、Peo以被动转运为主,Pb-a/Pa-b比例均在1左右,Evo、Rut以主动转运为主要转运机制,Evo的Pb-a/Pa-b比例＜0.5,Rut的Pb-a/Pa-b比例＜0.8;配伍6:1:6时Ber、Pal、Evo的摄取和外排均有所增加,Ber吸收减少,Rut摄取、吸收和外排均不同程度降低。配伍12:2:3和12:1:12时各代表成份吸收变化趋势大致相似,但在12:1:12配伍中Ber吸收增加、Evo细胞摄取量增多,这可能是引起两个配伍组产生相同药效的同时各有侧重点的原因。2.3戊己丸单方与P-gp相互作用研究方法:Ver抑制P-gp实验,采用肠外翻法,在肠外加入含有或不含有Ver（100μM）的测试药液,比较Ver对戊己丸组成单方中成分的吸收变化影响;Rho123外排实验,大鼠按实验分组分别给药5天,用肠外翻模型研究对Rho123的外排改变情况。结果:Ber、Pal、Evo在加入Ver后,在肠道各段吸收没有明显改变,Pal在加入Ver后吸收略有增加,尤其以结肠和回肠吸收增加较多,Peo在回肠中吸收比不加Ver时有显著增加（P＜0.05）,空肠和结肠改变不明显。对Rho123外排影响,提前服用Ver后,Rho123的外排显著减少（P＜0.01）,说明Ver抑制了P-gp,黄连组在空肠中对Rho123的外排也显著减少（P＜0.05）,回肠中外排有减少趋势。炒白芍组在回肠中Rho123外排显著增加（P＜0.01）,其余各组对Rho123外排没有明显影响。2.4戊己丸单方及不同配伍对MDR1-mRNA表达的影响方法:在Caco-2细胞中加入含药培养基培养2d,收集细胞后用Trizol一步法提取总RNA,逆转录合成cDNA,RT-PCR对MDR1-mRNA进行定量分析。结果:配伍6:1:6、12:2:3、12:1:12以及相同剂量黄连提取物单味药物均可以降低MDR1-mRNA的表达,制吴茱萸提取物及炒白芍提取物则可以诱导MDR1-mRNA表达,使其表达量增加。3结论本实验利用肠外翻模型和Caco-2细胞模型,研究戊己丸组方中单味药物和不同配伍下的代表成份吸收变化情况,结果显示戊己丸中代表成份在肠道中的吸收机制不同,不同配伍比例时吸收变化较大,经统计学分析最终得出黄连:制吴茱萸:炒白芍=6:3:6为最佳吸收配比,同时证明了黄连在方中的贡献度最大,确定其君药地位,制吴茱萸和炒白芍次之,为臣药。通过研究戊己丸单方与配伍对P-gp的相互作用,证明戊己丸单方与不同配比可能通过诱导/降低MDR1-mRNA的表达,产生药物间的相互作用,从而引起方中成份吸收的改变。
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