醋酸纤维素固定脂肪酶的研究与应用

论文摘要

酶作为一种生物催化剂,对环境十分敏感,易受物理、化学和生物等因素的影响而失活,而且反应后混入产品,纯化困难,不能实现连续操作,这些难以克服的现象大大限制了酶促反应在工业中的应用,在这种条件下,固定化酶的概念和技术得以提出和发展。脂肪酶（Lipase）是催化油脂水解的一类酶的总称,按照国际酶学委员会的命名分类原则,系统编号:EC3.1.1.3,系统名称:三脂酰甘油酰基水解酶,是一类特殊的酯键水解酶,其基本的功能就是催化其天然底物甘油酯水解为甘油和脂肪酸,能在油水界面上催化酯水解和醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、高聚物合成及立体异构体拆分等有机合成反应,是目前被重点研究的酶催化剂。论文以CA为原材料,用氨基硅烷偶联剂KH-792,使CA表面带有氨基活性基团;然后通过戊二醛作为交联剂固定脂肪酶。这种研究方法工艺比较简单,还没见报道。主要研究内容为:（1）本文首先研究了游离脂肪酶的基本性质,包括游离酶的最适pH值,最佳反应温度,储藏稳定性以及米氏常数Km值。在此过程中确定了考马斯亮蓝法测定蛋白质含量和以酚酞为指示剂,用NaOH滴定来对脂肪酸含量进行分析的方法通过实验确定了游离脂肪酶催化橄榄油水解的最佳反应条件为:温度:40℃,pH值:7.0。游离脂肪酶的米氏常数为7.68mol·L-1。（2）本文以醋酸纤维素（CA）作为原料,用化学接枝的方法对其进行改性,使其成为良好的酶固定化载体材料,重点考察了改性时间、偶联剂浓度对脂肪酶固定量和活性收率的影响。红外光谱测定了硅烷剂以化学键的形式结合在CA表面,使CA表面带有了氨基活性基团。同时利用有机元素分析仪分析了硅烷剂的接枝量。结果表明在硅烷剂浓度为6%,改性时间为24h时,硅烷偶联剂接枝率为11.66%,酶固定量为25.8mg·g-1,活性收率为43.3%。（3）本文以改性CA为固定化载体材料,采用化学交联法,制备固定化脂肪酶,通过测定酶活和固载率,从戊二醛浓度、活化时间、交联时间、给酶量四个因素优化了固定化条件,研究了固定化酶的酶学性能,并与游离酶进行了比较。结果表明将改性CA固定化脂肪酶的最优条件为:0.1g改性CA,首先用5%的戊二醛活化8h,再与4mL浓度为1.64mg·mL-1的脂肪酶液（由pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液配制）在4℃培养箱中交联10h,酶的固定化效率最好,最大酶固定量为34.5mg·g-1。经改性CA固定的脂肪酶具有更宽的适宜反应的温度范围和pH范围,热稳定性和贮藏稳定性明显优于游离酶。所得的固定化脂肪酶连续8批次操作后其相对活力保持在52.05%左右,显示出良好的稳定性。4℃下保存12d后,酶活力基本没有下降。（4）最后探讨了固定化脂肪酶在膜生物反应器中的应用,设计了一套简单的膜生物反应器,其中主要包括分离膜的选择和流程的设计,并用来水解橄榄油。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 酶的性质与用途
• 1.1.1 脂肪酶简介
• 1.1.2 脂肪酶的结构与催化机理
• 1.1.3 脂肪酶的应用
• 1.2 酶固定化技术
• 1.2.1 酶的固定化方法
• 1.2.2 酶的固定化载体材料
• 1.2.3 固定化方法的选择
• 1.2.4 固定化酶的性质
• 1.3 醋酸纤维素的性质
• 1.4 本课题的意义和主要研究内容
• 1.4.1 课题的意义和创新点
• 1.4.2 主要研究内容
• 2 游离脂肪酶性能的测定
• 2.1 引言
• 2.2 实验仪器与药品
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 溶液的配置
• 2.3.2 游离脂肪酶活性测定
• m测定'>2.3.3 游离脂肪酶米氏常数K_m测定
• 2.3.4 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
• 2.3.5 脂肪酶溶液中含蛋白质的浓度测定
• 2.4 试验结果与讨论
• 2.4.1 温度对游离脂肪酶水解活性的影响
• 2.4.2 pH值对游离脂肪酶水解活性的影响
• 2.4.3 游离脂肪酶储藏稳定性的测定
• m值的测定'>2.4.4 K_m值的测定
• 2.5 本章小结
• 3 醋酸纤维素的改性
• 3.1 引言
• 3.2 实验仪器与药品
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 CA表面改性原理
• 3.3.2 固定化原理
• 3.3.3 试验方法
• 3.3.4 检测方法
• 3.4 试验结果与讨论
• 3.4.1 改性前后的红外分析
• 3.4.2 反应时间的影响
• 3.4.3 硅烷剂浓度的影响
• 3.4.4 元素分析
• 3.5 本章小结
• 4 脂肪酶的固定化研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 载体的制备
• 4.3.2 固定化方法
• 4.3.3 检测方法
• 4.4 试验结果与讨论
• 4.4.1 戊二醛浓度的影响
• 4.4.2 活化时间的影响
• 4.4.3 交联时间的影响
• 4.4.4 给酶量的影响
• 4.4.5 固定酶最适pH值的测定
• 4.4.6 固定酶的最佳反应温度
• 4.4.7 固定酶的重复使用性
• 4.4.8 固定酶的储藏稳定性
• m值测定'>4.4.9 固定酶的K_m值测定
• 4.5 本章小结
• 5 固定化酶在膜生物反应器中的应用
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料和仪器
• 5.3 试验方法
• 5.3.1 固定化脂肪酶的制备
• 5.3.2 实验原理和装置
• 5.3.3 甘油含量的测定方法
• 5.4 试验结果与讨论
• 5.4.1 甘油可以透过聚醚砜超滤膜的试验验证
• 5.4.2 橄榄油乳化液能够被聚醚砜超滤膜截留的试验证明
• 5.4.3 膜反应器中橄榄油转化率的测定
• 5.4.4 普通反应器中橄榄油转化率随时间变化的测定
• 5.5 本章小结
• 6 结论
• 参考文献
• 附录 作者在攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢