不同精料日粮对奶牛瘤胃需氧及兼性厌氧菌和矿物质元素代谢的影响

论文摘要

本试验设计九个精料梯度的配方日粮（30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、70:30、100:0）饲喂干乳期成年荷斯坦奶牛（502±25kg）,对奶牛瘤胃液中的部分需氧和兼性厌氧菌进行了人工分离、PCR-16S rDNA分析和动态检测,同时还对奶牛血清中的部分常量元素和微量元素含量进行了检测,探讨了不同精料日粮水平对奶牛瘤胃内部分细菌和矿物质元素代谢的影响,并筛选出了适应高精料日粮条件下奶牛微生态制剂的备选菌种。试验结果如下:1以奶牛瘤胃液为原料,用人工培养基共分离到56株细菌,并对7株具代表性的细菌进行了PCR扩增,经序列同源性比较,最终把所分离的7株细菌鉴定为牛链球菌（A0625、A1212、0131）、蜡样芽孢杆菌（0113）、地衣芽孢杆菌（0091）、短小芽孢杆菌（0083）和嗜热链球菌（0123）。同时还发现随精料浓度的增加,牛链球菌、芽孢杆菌和嗜热链球菌的数量均呈不同程度的上升趋势,其中牛链球菌在30-45%组组间差异不显著（P>0.05）,50-100%组组间差异显著（P<0.05）,且与30-45%组相比也有显著差异（P<0.05）;嗜热链球菌30-55%组组间差异显著（P<0.05）,55-70%组组间差异不显著（P>0.05）,100%组与其它各组相比均差异显著（P<0.05）;芽孢杆菌30-40%组组间差异不显著（P>0.05）,但45-100%组组间均差异显著（P<0.05）。试验结果表明不同精料水平的日粮对奶牛瘤胃中的需氧及兼性厌氧菌有着不同程度影响,其中对牛链球菌影响最大,从系统发育分析可知所分离细菌虽没有形成新的细菌进化枝,但牛链球菌和嗜热链球菌的核苷酸序列仍发生了多处碱基突变。2随精料浓度的增加,血清Zn、Cu、Fe、Ca和Mg的浓度分别以50%和55%组为拐点呈先升高后降低的趋势,其中血清Cu、Fe、Mg和Ca在55%组的浓度显著高于30%和35%组（P<0.05）,与其它各组差异不显著（P>0.05）;血清Zn50%组的浓度与55%组差异不显著（P>0.05）,但与其它组相比差异显著（P<0.05）;血清P和血清Mn、K的浓度分别以50%和55%组为拐点呈先下降后上升趋势,其中血清Mn、K于55%组的浓度显著高于30%、35%、40%组（P<0.05）,与60%、70%、100%组相比,血清Mn的浓度变化差异显著（P<0.05）,而血清K的浓度变化差异不显著（P>0.05）,血清P的浓度在100%组显著高于其它各组（P<0.05）,其余各日粮组组间差异不显著（P>0.05）;血清Na的浓度一直呈上升趋势,55%、60%、70%、100%组显著高于30%、35%、40%、45%组（P<0.05）,且55%、60%,70%、100%组组间差异显著（P<0.05）,30%、35%、40%、45%、50%组组间差异不显著（P>0.05）。试验结果表明不同精料水平的日粮对奶牛血清中矿物质元素的浓度有着不同程度影响,其中对常量元素Ca、Mg、K和微量元素Mn、Zn的血清浓度影响最大。3本研究直接从饲喂不同精料日粮的奶牛瘤胃中分离到蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌,它们均可作为奶牛微生态制剂的备选菌株。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 1 奶牛瘤胃需氧及兼性厌氧菌的国内外研究进展
• 2 奶牛机体矿物质元素的国内外研究进展
• 3 16S rDNA 基因理论
• 4 矿物质元素
• 5 试验检测的指标及意义
• 试验一 试验奶牛瘤胃需氧及兼性厌氧菌的分离、鉴定与动态变化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验日粮及设计
• 1.2.1 日粮组成
• 1.2.2 试验设计
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 瘤胃液的采集及pH 值测定
• 1.3.2 瘤胃细菌的培养、镜检与计数
• 1.3.3 瘤胃细菌的分离、传代与保存
• 1.3.4 瘤胃细菌的 PCR-16S rDNA 分析
• 1.3.4.1 瘤胃试验菌株的复苏和培养
• 1.3.4.2 试验菌株模板 DNA 的提取
• 1.3.4.2.1 操作步骤
• 1.3.4.2.2 模板DNA 的检测
• 1.3.4.3 试验菌株16S rDNA基因的PCR扩增
• 1.3.4.4 PCR 产物的回收和纯化
• 1.3.4.4.1 PCR产物的回收、纯化
• 1.3.4.4.2 胶回收的检测
• 1.3.4.5 16S rDNA 基因的克隆、测序
• 1.3.4.5.1 重组载体pT16S rDNA 的构建
• 1.3.4.5.2 重组载体的转化
• 1.3.4.5.3 pT16S rDNA 单克隆细菌的培养
• 1.3.4.5.4 重组质粒 DNA 的提取
• 1.3.4.5.5 pT16S rDNA 的单/双酶切鉴定
• 1.3.4.5.6 测序
• 1.3.4.6 细菌16S rDNA 鉴定、同源性分析与系统发育树的构建
• 2 试验结果
• 2.1 瘤胃液pH 值
• 2.2 细菌菌落形态观察
• 2.3 细菌的染色、镜检结果
• 2.4 细菌模板DNA 的电泳图谱
• 2.5 各菌株16S rDNA基因PCR扩增电泳图谱
• 2.6 PCR产物回收后的电泳图谱
• 2.7 pT16S rDNA 的 HindШ单酶切图谱
• 2.8 pT16S rDNA 的HindШ＋EcoRⅠ双酶切图谱
• 2.9 各菌株16S rDNA 基因测序结果
• 2.10 各菌株16S rDNA 基因 BLAST 比对结果
• 2.11 各菌株16S rDNA 基因系统发育树的建立
• 2.11.1 无根16S rDNA 序列系统发育树
• 2.11.2 有根16S rDNA 序列系统发育树
• 2.12 16S rDNA 基因部分序列分析
• 2.13 不同精料梯度日粮条件下所分离瘤胃细菌的动态变化结果
• 3 讨论
• 试验二 日粮对试验奶牛血清中部分矿物质元素代谢影响的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验动物
• 1.2 样品的采集与处理
• 1.2.1 样品的采集
• 1.2.2 样品的处理
• 1.3 主要仪器与试剂
• 1.4 主要配制试剂
• 1.5 检测项目与方法
• 2 试验结果
• 2.1 血清中Ca、P、Mg、Na、K 含量的测定结果
• 2.2 血清中Zn C、u M、n F、e 含量的测定结果
• 3 讨论
• 3.1 日粮精料水平与奶牛机体常量元素含量变化关系
• 3.2 日粮精料水平与奶牛机体微量元素含量变化关系
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读学位期间发表论文情况