胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒的构建及其对神经胶质瘤细胞和大鼠脊髓损伤模型神经细胞凋亡影响的实验研究

论文摘要

脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）后,如果能够减少神经细胞的凋亡,降低继发性损伤,对于挽救濒临死亡的神经元、促进神经再生具有重要意义。研究发现,胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor, IGF-1）对于维持神经细胞的生存、生长和损伤后的修复具有极其重要的作用,而关于IGF-1对急性脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响作用的研究,目前鲜有报道。为了研究IGF-1对于急性脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响作用,本研究应用质粒载体介导IGF-1基因转染的方式进行了体外及体内试验。在体外实验中,构建了IGF-1真核细胞表达质粒,应用脂质体介导质粒转基因的方法,转染神经胶质瘤（C6）细胞,ELISA及流式细胞术检测证实转染成功,体外诱导细胞凋亡,流式细胞术检测结果证实,IGF-1可减少体外培养的神经胶质瘤细胞的凋亡。在体内实验中,首先制作了大鼠SCI模型,并分组（IGF-1治疗组、模型组及空白对照组）进行不同干预;IGF-1治疗组,并应用免疫组化法证实转染成功、应用透射电镜、TUNEL等证实IGF-1转染后,SCI大鼠脊髓损伤区神经元细胞凋亡明显减少,BBB评分IGF-1治疗组优于模型组。本研究结果表明:应用脂质体介导重组IGF-1质粒的方法可以在体外转染C6细胞,并抑制C6细胞的凋亡;IGF-1真核细胞表达载体可以将IGF-1基因转染到大鼠脊髓神经细胞,并稳定表达IGF-1蛋白到转染后三周。证实IGF-1具有抑制神经细胞细胞凋亡、保护残存神经功能的作用。实验结果为进一步揭示脊髓损伤后神经细胞凋亡的机制及治疗脊髓损伤提供新的治疗方法具有重要意义。

论文目录

• 英文缩写
• 绪论
• 1. 脊髓损伤后神经细胞凋亡的机制研究
• 1.1 细胞凋亡的概念及形态、生化改变
• 1.2 细胞凋亡的检测方法
• 1.3 脊髓损伤细胞凋亡的主要诱导因素
• 1.4 急性脊髓损伤细胞调亡相关基因研究进展
• 1.5 脊髓损伤后的凋亡蛋白酶（Caspase）的作用
• 1.6 死亡受体和脊髓损伤后细胞凋亡的信号传导通路
• 1.7 目前关于脊髓损伤细胞凋亡治疗的研究
• 2. 基因治疗研究发展及发展前景
• 2.1 基因治疗的基本概念
• 2.2 基因治疗的途径
• 2.3 基因治疗的基因导入系统
• 2.4 基因治疗需要解决的问题
• 2.5 基因治疗的前景
• 3. 人胰岛素样生长因子1 在神经系统损伤中的治疗作用
• 3.1 IGF-1 的结构及其作用方式
• 3.2 IGF-1 在神经系统的作用
• 3.3 IGF-1 的神经系统保护作用的作用机制
• 4. 本研究的立题依据
• 实验一 IGF-1真核细胞表达质粒的构建及其对神经胶质瘤细胞凋亡的影响
• 1. 实验材料
• 1.1 试剂
• 1.2 器材
• 1.3 主要仪器
• 1.4 质粒与菌株
• 1.5 细胞株
• 2. 实验方法
• 2.1 表达载体构建
• 2.2 体外实验技术
• 2.3 统计学方法
• 3. 结果
• 3.1 人胰岛素样生长因子1 重组质粒的构建
• 3.2 cDNA3.1-hIGF1转染神经胶质瘤细胞
• 3.3 稳定转染细胞株的Western blot检测鉴定
• 3.4 ELISA法测定C6细胞上清液中hIGF-1含量
• 3.5 流式细胞术检测蛋白质表达
• 3.6 IGF-1对细胞凋亡的影响（FCM）
• 3.7 IGF-1对细胞凋亡的影响（TUNEL）
• 4. 讨论
• 实验二 pcDNA-hIGF1对SCI大鼠模型神经细胞凋亡的影响
• 1. 实验材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 2. 实验方法
• 2.1 大鼠SCI模型建立及pcDNA-hIGF1体内转染
• 2.2 SCI大鼠脊髓透射电镜观察
• 2.3 动物脊髓标本切片HE、尼氏染色
• 2.4 动物脊髓标本免疫组化检测
• 2.5 SCI大鼠脊髓神经细胞凋亡的检测（TUNEL Assay）
• 2.6 SCI大鼠运动功能的检测
• 2.7 统计学方法
• 3. 实验结果
• 3.1 大鼠SCI模型建立
• 3.2 电镜观察结果
• 3.3 HE 及尼氏染色
• 3.4 大鼠脊髓内神经细胞IGF-1蛋白免疫组化检测
• 3.5 SCI大鼠脊髓神经细胞凋亡的检测（TUNEL assay）
• 3.6 实验动物肢体功能检测
• 4. 讨论
• 4.1 SCI模型的建立以及BBB评分
• 4.2 脊髓损伤后神经细胞凋亡的时间及空间分布特点
• 4.3 IGF-1转染对神经细胞凋亡的影响作用
• 结论
• 实验不足与展望
• 参考文献
• 附图
• 攻读博士期间发表论文
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢