论文摘要
烟曲霉菌是存在于空气中常见的腐生丝状真菌病原体,其传播方式为向空气中释放分生孢子,分生孢子为灰绿色,直径仅为2-3μМ,极易进入肺泡,据估计每人每天吸入几百的烟曲霉菌分生孢子。其致病性依赖于宿主的免疫状态,在免疫活性个体中,由于宿主的免疫系统可以将其灭活而很少引起疾病,然而,当它感染免疫缺陷病人时,如器官移植术后,白血病,HIV感染等,可引起侵袭性烟曲霉菌病（Invasive Aspergillosis, IA）,死亡率高达85%。在过去的十年里,随着免疫受损病人的增加和免疫抑制治疗的广泛使用,并由于该感染诊断的困难和缺乏高效低毒的抗真菌治疗措施,侵袭性烟曲霉菌病的发病率甚至已经超过了最常见的真菌感染—侵袭性念珠菌病,而成为主要的机会病原性真菌。烟曲霉菌基因组序列测序已经完成,功能基因组学方法可以利用这些信息识别所有潜在的药物作用靶位,这就要通过对这些病原性菌株进行基因学操作,识别毒力因子,分析表型变化。识别烟曲霉菌生命必需基因是发现新的抗真菌药物的第一步。分子生物学的高速发展为病原微生物功能基因研究提供了丰富的技术,如体内表达技术（in vivo expression technology, IVET）、差异荧光诱导（differential fluorescence induction, DFI）等正向筛选鉴定方法,转座子Tn5介导的逆向遗传突变（transpoton Tn5-based reverse genetic mutation）和信号标签突变（Signature-tagged mutagenesis,STM）等反向鉴定技术,另外,还有差减杂交、差异显示等方法。目前已有多种技术用于了解烟曲霉菌基因功能。虽然利用这些技术在烟曲霉菌功能基因,包括毒力相关基因的筛选上取得了一些有价值的研究成果,但是,充分发掘和利用全基因组信息无疑将会大大加深该领域的研究进展。双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默的过程称为RNA干涉（RNA interference , RNAi）。RNAi是指在多种生物细胞内,由双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）介导同源序列mRNA的特异性降解,而导致的基因沉默（gene silencing）现象。因RNAi所导致的基因沉默发生在转录后水平,所以被称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）。RNAi具有特异性和高效性特点,它作为新兴的基因阻断技术,目前已广泛应用于基因功能及基因治疗的相关研究。Liu等人在新型隐球菌中应用RNAi技术,构建以pACT为启动子,靶基因正反双向序列被250bpGFP序列隔开的发夹结构载体,沉默靶基因,掀开了在真菌研究中应用RNAi技术的新篇章。研究者在真菌粗糙链孢霉中识别了三个基因具有RNAi沉默分子机制:一是QDE1,它与在西红柿中发现的RNA依赖的RNA聚合酶相似;二是QDE2与RDE1同源,RDE1是秀丽线虫中双链的DNA干涉所必需的;三是QDE3,它是RecQ DNA解螺旋酶家族的成员。烟曲霉菌数据库http://tigrblast.tigr.orgufmg中可查到与它们同源的蛋白, blast score分别是6×10-122,2×10-65,3×10-154,由此可见,烟曲霉菌中可能存在RNAi机制, RNAi可用于研究烟曲霉菌基因功能。本研究应用dsRNA介导RNAi特异性沉默烟曲霉菌色素形成相关基因arp1,初步探讨了RNAi在烟曲霉菌基因功能研究中的应用;并且,运用该方法研究烟曲霉菌生命必需基因nudC,进一步证实了nudC基因为烟曲霉菌生命必需基因。第一部分dsRNA介导的RNAi沉默烟曲霉菌色素形成相关基因arp1的研究: arp1基因编码一种脱水酶,该酶在灰绿色真菌的二羟基萘黑色素形成路径中发挥作用,沉默arp1基因产生灰白色的分生孢子,其可有助于人补体C3在分生孢子上的沉积,而有力于吞噬细胞吞噬吸入人体的分生孢子。采用液氮研磨烟曲霉菌,提取总RNA,用含T7启动子序列的特异引物进行RT-PCR,扩增出两端含T7启动子序列的arp1基因。为了计算转化率,合成了5’-FAM标记的siRNA并用其电转化烟曲霉菌。以测序正确的两端含T7启动子序列的arp1基因片段为模版使用MEGAscript RNAi Kit体外转录合成dsRNA,用合成的dsRNA电转化烟曲霉菌后,观察烟曲霉菌表型变化,RT-PCR分析mRNA变化。结果:5’-FAM标记的siRNA-arp1电穿孔转化烟区霉菌12h后,经荧光倒置显微镜下观察,结果显示,每次成功转染的转化效率可达到50%～55%;以dsRNA电转化烟曲霉菌后,转化菌的arp1基因mRNA水平降低,转化菌,阴性对照（mock和无关dsRNA对照）与18srRNA的比值分别为0.58±0.07;1.10±0.05;1.05±0.10,有显著性差异（P<0.05）;并且,转化菌产生与母代绿色菌株不同的灰色菌株,类似基因敲除的表型。第二部分dsRNA介导的RNAi沉默烟曲霉菌nudC基因的研究: nudC基因在构巢曲霉中是生命必需基因,它参与多种细胞功能如核移位,细胞壁沉积。采用同研究arp1基因相同的方法扩增nudC基因,以序列正确的线性nudC基因片段为模版,使用MEGAscript? RNAi Kit体外转录合成dsRNA,用合成的dsRNA电转化烟曲霉菌后,观察烟曲霉菌表型变化,RT-PCR分析mRNA变化。结果:转化后,可见转化菌生长受到明显抑制,而阴性对照菌株生长正常。相差显微镜下可见阴性对照菌丝萌芽生长,而转化菌孢子肿胀,菌丝生长抑制;转化菌的nudC基因mRNA水平降低,与18srRNA的比值为0.50±0.07,显著低于mock和无关dsRNA对照与18srRNA的比值,1.09±0.06,1.10±0.09（F=9.38,P<0.05）。总之,烟曲霉菌色素形成相关基因arp1和烟曲霉菌nudC基因均为烟曲霉菌毒力相关基因。本研究用体外转录制备dsRNA介导RNAi特异性沉默靶基因,产生类似基因敲除的表型,证实RNAi是丝状真菌中特异性下调基因表达及研究基因功能的有力工具。本研究为研究烟曲霉菌靶基因功能,识别和筛选烟曲霉菌生命必需基因,寻找新的药物干预靶位,研制新型抗烟曲霉菌药物奠定了基础,具有潜在的社会效益和经济效益。