一种核苷嘧啶类抗真菌抗生素的分离纯化及抗菌活性的研究

论文摘要

近年来,深部真菌感染疾病的感染率逐渐提高,对患者的健康和生命造成了很大的威胁。课题组筛选得到一株芽孢杆菌,能产生核苷嘧啶类抗真菌抗生素,对引起深部真菌感染的白色念珠菌具有很好的抑制作用。论文在研究该抗生素发酵工艺基础上,重点研究该抗生素的分离纯化工艺,为该抗生素的进一步开发和利用奠定了基础。本论文首先对该抗生素的摇瓶培养工艺进行了优化,确定了较优的发酵条件:pH 6.5,接种量8%,转速200 r/min,装液量40mL/250 mL,28℃下摇瓶发酵48h后产抗水平最高达到940.35 U/mL;进一步在通气搅拌罐中进行了放大,在摇瓶得到的优化条件的基础上,在通气量为2 vvm,搅拌转速200 r/min,装液量60%（v/v）条件下,培养36h后产抗水平达到最高,达到950.5 U/mL,比摇瓶培养略有提高。论文对抗生素发酵液的理化性质作了简单的考察,结果表明:该抗生素具有较强的热稳定性;在酸、中性环境下比较稳定,碱性环境下不稳定;低温条件下（-20℃）,该抗生素发酵液放置时间在9天以内均可保持较高的活性;该抗生素对光照不敏感;是一种极性酸性水溶性抗生素。在以上研究基础上,论文重点研究了该抗生素的分离纯化工艺条件。本论文建立的抗生素分离工艺为:发酵液絮凝预处理→调发酵液pH 2.0→H41大孔树脂脱色→HD-8离子交换树脂纯化→（制备高效液相精制）→冻干。通过对工艺条件的优化,实现该抗生素的分离和纯化。本工艺路线首先采用了壳聚糖絮凝除菌,优化后的条件为:pH 2.0、絮凝剂用量为0.4g/L、温度为30℃,絮凝率达到84.6%;以草酸和盐酸为沉淀剂,分别在pH 4.0和2.0下沉淀发酵液中的金属离子和杂蛋白;大孔吸附树脂H41对发酵液进行脱色,脱色条件为:pH为2.0的发酵液以2 BV/h的流速上柱,脱色率达到95.1%,抗生素效价提高到2332.18 U/mL;选取了阳离子树脂HD-8作离子交换层析实验,优化后的工艺条件为:pH为2.0的上柱液以2 BV/h的流速上柱,在吸附达到平衡后用去离子水冲洗后,再用0.6mol/L的NH3·H2O以4 BV/h的流速洗脱。洗脱液减压蒸馏,冷冻干燥,得到淡黄色粉末,效价提高到5855.5 U/mg。整个分离过程的总收率为63.4%。HPLC检测离子交换分离得到的产品,归一法测定其纯度为70.24%;抗生素粗品经制备HPLC精制后,纯度达到95.75%,最终效价达到8280.5 U/mg。经质谱分析,其分子量为520.68。紫外扫描发现该抗生素在298 nm处有强吸收峰。对酵母类真菌具有较好的抑菌效果,抗生素粗品对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.1807μg/mL。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 立题背景及研究意义
• 1.2 抗真菌抗生素的抗菌机理及发展方向
• 1.2.1 作用于真菌细胞壁
• 1.2.2 作用于真菌细胞膜
• 1.2.3 其他可能的抗真菌靶点
• 1.3 抗真菌药物的应用现状
• 1.4 抗生素的分离方法
• 1.4.1 发酵液预处理
• 1.4.2 溶剂萃取法
• 1.4.3 吸附法
• 1.4.4 离子交换法
• 1.4.5 色谱法
• 1.5 本课题的研究意义及主要任务
• 第二章 抗真菌抗生素的发酵工艺研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.3 分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 葡萄糖标准曲线
• 2.3.2 制霉菌素标准曲线
• 2.3.3 发酵培养条件的优化
• 2.3.4 分批发酵过程动力学的研究
• 2.4 小结
• 第三章 发酵液中抗生素理化性质的初探
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 检测方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 稳定性
• 3.3.2 纸电泳实验结果
• 3.3.3 捷克八溶剂系统纸层析结果
• 3.4 小结
• 第四章 抗生素分离与纯化工艺的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 发酵液及检验菌
• 4.2.2 树脂
• 4.2.3 试剂与仪器设备
• 4.3 检测方法
• 4.3.1 抗菌活性的测定
• 4.3.2 高效液相检测
• 4.4 实验方法
• 4.4.1 发酵液的预处理
• 4.4.2 大孔吸附树脂脱色
• 4.4.3 离子交换树脂层析
• 4.4.4 制备高效液相色谱精制抗生素
• 4.4.5 紫外可见吸收光谱扫描
• 4.4.6 抑菌性能
• 4.5 结果与讨论
• 4.5.1 发酵液的絮凝除菌工艺优化
• 4.5.2 发酵液中高价金属离子及杂蛋白的去除
• 4.5.3 大孔吸附树脂脱色
• 4.5.4 离子交换树脂层析
• 4.5.5 高效液相色谱分析和精制抗生素
• 4.5.6 紫外可见光谱扫描
• 4.5.7 抑菌性能检测
• 4.6 小结
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文