GPI-PLD基因过表达对肝癌HepG2细胞株的影响

论文摘要

目的：用糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D（GPI-PLD）基因转染肝癌HepG2细胞，初步研究GPI-PLD基因过度表达对肝癌细胞株HepG2细胞的影响，包括对其生长及凋亡、细胞膜上糖基化磷脂酰肌醇（GPI）锚定的蛋白质释放情况等方面的影响，为肝癌的GPI-PLD基因治疗提供理论依据。方法：用脂质体转染法将本室已经构建的GPI-PLD真核表达载体pcDNA3.1（+）／GPI-PLD转入HepG2细胞，以未转染的HepG2细胞及转染空载体pcDNA3.1（+）的细胞为对照，以G418筛选出阳性细胞克隆。RT-PCR法鉴定GPI-PLD基因的mRNA表达水平，利用自制具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶（PLAP）做底物，通过曲拉通-114（TX-114）分相，定量检测GPI-PLD活性；基因转染后细胞生物学特性的观察包括MTT法检测各组细胞增殖活性，细胞计数绘制生长曲线，荧光染色观察HepG2细胞形态学改变，台盼蓝排斥法观察补体介导的细胞毒（CDC）杀伤率；运用ELISA检测GPI锚定癌胚抗原（CEA）的表达和释放情况，分光光度法检测GPI锚定PLAP的表达和释放情况。结果：1．RT-PCR结果和GPI-PLD酶活性测定表明，稳定高表达GPI-PLD的HepG2细胞系已经建立。①G418筛选后，GPI-PLD稳定转染HepG2细胞的GPI-PLD mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染组明显增高，差异有显著性（P＜0.05），各组细胞GPI-PLDmRNA的相对表达量用积分分光密度比值（IA比值）表示，分别为0.926±0.124、0.164±0.057和0.205±0.045。②GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后，GPI-PLD活性较转染空质粒组和未转染组明显增高，差异有显著性意义（P＜0.01），各组细胞的GPI-PLD活性（％）分别为13.4±4.44、4.82±2.99和6.52±2.34。③GPI-PLD转染HepG2细胞后，GPI锚定的蛋白质如CEA、PLAP等被GPI-PLD水解释放入培养基，GPI-PLD转染组细胞培养基上清CEA浓度较其他两组明显增高，具有显著性差异（P＜0.01），超声粉碎细胞上清和细胞培养基上清PLAP的活性测定，转染空质粒组和未转染细胞组PLAP活性主要分布于超声粉碎细胞上清液中，而GPI-PLD转染组细胞PLAP活性绝大部分分布于细胞培养液。2．GPI-PLD基因过度表达对HepG2细胞有影响。①GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后，GPI-PLD转染组较转染空质粒组和未转染组细胞增殖能力明显减弱。②GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后，较转染空质粒组和未转染组细胞对补体杀伤的敏感性增强，具有显著性差异（P＜0.01），各组细胞的杀伤率（％）分别为16.4±2.10、5.7±1.15、5.9±1.39。③GPI-PLD稳定转染HepG2细胞后，呈现典型的凋亡细胞形态特征。结论：1．成功将GPI-PLD基因转染入HepG2细胞，并在细胞中稳定表达。2．本试验证实GPI-PLD基因有抗肿瘤的作用。即通过上调GPI-PLD活性，释放GPI锚定蛋白，增强肿瘤细胞对补体杀伤的敏感性，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖。本试验为肿瘤GPI-PLD基因治疗奠定了理论与实验基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词汇表
• 前言
• 实验技术路线图
• 第一章 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 携带pcDNA3.1（+）/GIP-PLD质粒的TG1大肠杆菌扩增培养及鉴定
• 2.2 重组质粒pcDNA3.1（+）/GPI-PLD转染HepG2细胞、筛选并鉴定
• 2.3 HepG2细胞GPI-PLD酶活性水平测定
• 2.4 ELISA检测GPI锚定CEA
• 2.5 分光光度法测定GPI锚定PLAP
• 2.6 基因转染后细胞生物学特性
• 2.7 补体介导的细胞毒试验（台盼蓝排斥法）
• 2.8 统计学分析
• 第二章 结果
• 1 质粒提取鉴定结果
• 2 稳定转染GPI-PLD基因后G418筛选的结果
• 3 细胞总RNA提取及鉴定结果
• 4 RT-PCR法检测GPI-PLD基因mRNA的表达量变化
• 5 细胞GPI-PLD酶活性测定结果
• 6 稳定转染的HepG2细胞释放GPI锚定CEA水平测定
• 7 稳定转染的HepG2细胞释放GPI锚定PLAP的检测
• 8 基因转染后细胞生物学特性观察
• 9 补体介导的细胞毒试验
• 第三章 讨论
• 1 肝脏、肝细胞癌与GPI-PLD
• 2 GPI-PLD对肿瘤细胞的影响
• 第四章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间完成、发表论文情况