跨膜型TNF-α信号肽稳定表达株的建立及其功能研究

论文摘要

肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）具有多种生物学功能,在体内以跨膜型（transmembrane TNF-α, TM-TNF-α）和分泌型（secreted TNF-α, S-TNF-α）两种形式发挥作用。本室及其他实验室工作表明,两型TNF-α具有不同的生物学功能,TM-TNF-α比S-TNF-α具有更广的杀瘤谱,可杀伤S-TNF-α耐受的肿瘤细胞;TM-TNF-α主要引起靶细胞凋亡,S-TNF-α则主要引起靶细胞坏死。TM-TNF-α不但可以作为配体,与受体结合传递正向信号,而且还可作为受体向效应细胞传递反向信号。由于TM-TNF-α是S-TNF-α的前体,在一级结构上,TM-TNF-α比S-TNF-α多一个由76个氨基酸组成的信号肽（signal peptide, SP）,该信号肽不仅将TM-TNF-α锚定在细胞膜表面,且其胞浆段参与传递反向信号。我们的前期研究证实肿瘤细胞可通过TM-TNF-α的反向信号抵抗凋亡,为排除TM-TNF-α正向信号的影响,本研究建立稳定表达TNF-SP的乳腺癌细胞株,并初步研究TNF-SP反向信号对肿瘤行为的影响,为探讨TM-TNF-α反向信号在肿瘤生长中的作用提供了有力的实验证据。该研究主要结果如下:一、建立稳定高效表达TNF-SP的乳腺癌细胞株采用脂质体转染的方法将插入有TNF-SP的真核表达载体pIRES2-EGFP/TNF-SP和空载体pIRES2-EGFP转入人乳腺癌细胞MCF7,经G418抗性筛选,获得克隆化细胞株,借助流式细胞仪筛选出高表达TNF-SP的细胞株,进一步用Western blotting证实阳性克隆株中大约10kD处出现特异性条带,表明有TNF-SP的表达,而对照细胞未见相同分子量的条带。提示已成功建立表达TNF-SP的乳腺癌细胞株。二、TNF-SP反向信号促进肿瘤细胞的存活1.高表达TNF-SP的MCF7细胞对S-TNF-α的细胞毒作用产生抵抗:MTT的结果显示转染TNF-SP的细胞可抵抗S-TNF-α的杀伤（杀伤率3.57%）,而转染空载的MCF7和未转染的MCF7细胞则对S-TNF-α杀伤活性敏感（杀伤率分别是22.45%、22.24%）,前者与后两对照者之间差异显著（P<0.01）,提示转染TNF-SP可使原TNF敏感株变为耐受株。2. TNF-SP通过反向信号激活NF-κB,使MCF7细胞抵抗S-TNF-α胞毒效应: ELISA结果显示转染TNF-SP可明显活化MCF7细胞的NF-κB,S-TNF-α可进一步使其活性增强,而其他两种对照细胞NF-κB并未活化。应用NF-κB抑制剂PDTC预处理细胞后,可抑制稳转细胞的NF-κB活性,恢复MCF7细胞对S-TNF-α胞毒效应的敏感性（杀伤率增加到36.4%,P<0.01）,同时也能增加两种对照细胞对S-TNF-α的敏感程度,使其杀伤率明显增强（杀伤率分别上升到50.64%和53.44%,P<0.01）。3. TNF-SP反向信号促进MCF7细胞胞浆I-κB的降解:Western blotting结果显示转染TNF-SP的MCF7细胞胞浆内I-κB的水平低于未转染和转染空载体的MCF7细胞,同时发现这种高表达TNF-SP的细胞对S-TNF-α短暂刺激更敏感,胞浆内IκB-α降解增加显著,而其他两种对照MCF7细胞胞浆的I-κB含量变化不明显。4. TNF-SP反向信号促使MCF7细胞产生NO增加:NO检测显示TNF-SP稳定转染的细胞产生NO的量较未转染和转染空载体的MCF7细胞增加约50.68% （p<0.01）。综上所述,本研究成功建立了能稳定表达TNF-SP的肿瘤细胞株（TNF-SP/MCF7细胞）,并证实转染TNF-SP基因能通过组成性激活NF-κB的活性而使MCF7细胞抵抗S-TNF-α介导的细胞毒效应,提高NO的产生。上述结果提示TNF-SP可能通过其胞内的一段活化基序参与TM-TNF-α的反向信号,最终活化NF-κB,促使肿瘤细胞抵抗凋亡刺激而存活。此外,本课题建立的TNF-SP/MCF7细胞系为进一步研究TM-TNF-α的反向信号提供了一个良好的实验工具。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 致谢