云芝液体深层发酵天冬氨酸蛋白酶抑制剂的研究

论文摘要

本论文主要对云芝液体深层发酵天冬氨酸蛋白酶抑制剂的发酵条件、分离纯化及基本特性等进行了研究,主要结果如下:对甜芝、云芝、韩芝、赤芝G-8等4株菌进行平板培养,比较菌丝体生长速度,其中云芝和赤芝G-8生长最快,速度约为13.7mm/d,且云芝菌丝体最密,相比之下生长最慢的韩芝只有5.0mm/d。对4株菌进行液体深层发酵,生物量以云芝最高,约为15.06g/L,是韩芝的2.83倍;将发酵液进行真空旋转蒸发浓缩干燥成粉及真空冷冻干燥成粉,然后再进行热水抽提、乙醇沉淀,比较所得物质对胃蛋白酶的抑制效果,仍以云芝发酵组最好,冻干粉抽提液30%-80%醇沉区段的沉淀对胃蛋白酶的抑制率可达29.3%,烘干粉同样处理后也能达到20%左右。比较了云芝发酵液细胞破碎前后对胃蛋白酶的抑制效果,破碎后对胃蛋白酶的抑制率由破碎前的0.53%提高到37.2%,说明云芝胞内确实存对胃蛋白酶起抑制作用的物质。研究了超声波细胞破碎条件对云芝胞内天冬氨酸蛋白酶抑制剂提取的影响,确定最佳超声条件为:超声时间10min、超声功率300W、处理量40mL、超声温度20℃。从细胞破碎液中分离得一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂（CVPI）,建立了云芝胞内天冬氨酸蛋白酶抑制剂的纯化制备工艺为:摇瓶发酵-细胞破碎-大孔树脂D101脱色-DEAE52离子交换层析-ACA54分子筛层析进行CVPI的纯度鉴定及分子量测定。凝胶过滤测定CVPI的相对表观分子量约为23442,主要成分为糖和蛋白质,蛋白比糖约为2.5;CVPI热稳定性较好,100℃保温30分钟后抑制活性几乎没有损失;CVPI的pH稳定范围为3.5～7.5;抑制活性受温度影响不大,0～100℃基本稳定;抑制效果在2小时内随反应时间延长上升较快,2小时后基本不再升高;抑制剂底物特异性研究表明,CVPI对天冬氨酸族的蛋白酶抑制活性较高,以对胃蛋白酶的抑制效果最强;CVPI对胃蛋白酶和蛋白酶A作用时的Ki值分别分别为0.82,1.32μmol/L;CVPI对胃蛋白酶和蛋白酶A的半抑制浓度IC50值分别约为15和29μg/mL;动力学方法研究（Lineweaver-Burk作图法）发现,CVPI是胃蛋白酶的非竞争与反竞争混合型抑制剂,是蛋白酶A的竞争与反竞争混合型抑制剂。利用单因素实验,找到云芝液体深层发酵CVPI的主要影响因子为接种量、起始pH和装液量。在单因素实验的基础上,采用响应面分析法,对培养条件进行了优化,得最佳培养条件:发酵温度为26℃,发酵时间为120小时,转速170r/min,装液量为71.31mL/250mL,起始pH为5.97,接种量为13.96%。优化后的抑制剂产量为10.13IU/mL,比优化前提高了172.3%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究现状
• 1.2.1 真菌液体深层发酵的研究
• 1.2.2 蛋白酶抑制剂的研究
• 1.2.3 天冬氨酸蛋白酶抑制剂的来源
• 1.2.4 以胃蛋白酶作为天冬氨酸蛋白酶抑制剂筛选靶酶的意义
• 1.3 立题意义
• 1.4 本论文主要研究内容
• 第二章 产天冬氨酸蛋白酶抑制剂菌种的筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 供试菌株
• 2.2.2 主要试剂与仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 培养方法
• 2.2.5 不同菌株平板培养的菌丝体形态及生长速度比较
• 2.2.6 云芝成粉条件研究
• 2.2.7 细胞破碎前后云芝发酵液成分及抑制活性比较
• 2.2.8 不同菌株发酵蛋白酶抑制剂的比较
• 2.2.9 分析测定方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 不同菌株菌丝体形态及生长速度的比较
• 2.3.2 云芝生长曲线的绘制
• 2.3.3 发酵液成粉条件研究
• 2.3.4 云芝发酵液细胞破碎前后组分的基本分析
• 2.3.5 不同菌株发酵蛋白酶抑制剂的比较
• 2.4 本章小结
• 第三章 云芝胞内天冬氨酸蛋白酶抑制剂的提取及性质研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 超声波细胞破碎
• 3.2.4 脱色
• 3.2.5 离子交换层析
• 3.2.6 天冬氨酸蛋白酶抑制剂的纯度鉴定及分子量标定
• 3.2.7 天冬氨酸蛋白酶抑制剂的基本性质研究
• 3.2.8 分析测定方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 云芝发酵液超声波破碎细胞的条件研究
• 3.3.2 脱色
• 3.3.3 抑制剂的进一步纯化
• 3.3.4 抑制剂的纯度鉴定及分子量测定
• 3.3.5 蛋白酶抑制剂的基本性质
• 3.4 本章小结
• 第四章 云芝发酵天冬氨酸蛋白酶抑制剂的条件优化
• 前言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 供试菌株
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 分析测定方法
• 4.1.6 单因素实验
• 4.1.7 响应曲面（RSM）实验设计
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 单因素实验
• 4.2.2 响应曲面实验
• 4.3 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 专利申请
• 附页