论文摘要
心力衰竭是各种心脏病进展的恶性归宿之一,其发病率和死亡率在世界各地均很高。心肌细胞的增生能力有限且数目相对固定,故心肌细胞凋亡在心力衰竭的发生发展中的重要作用已成为研究者关注的热点之一。近年来,已经成功的建立了多种动物模型来研究心力衰竭过程中的心肌细胞凋亡。但是由于动物模型在研究心力衰竭发生机制中的局限性,体外培养心肌细胞,是研究心肌细胞生理和病理机制的重要手段。但心肌细胞是终分化细胞,原代培养细胞不易传代,故体外大量培养难度大,从而限制了其应用范围。大鼠心肌干细胞系H9C2在一定范围可替代原代心肌细胞。氧化应激在心力衰竭发生过程中发挥重要作用,活性氧族（reactive oxygen species ROS）可损伤细胞内的大分子物质（如DNA,蛋白质,脂质）,诱发细胞凋亡。去甲肾上腺素（noradrenaline,NE）是交感神经主要神经递质,是心肌细胞的生理和病理过程中不可缺少的分子,能以时间-剂量依赖的方式刺激心肌细胞内ROS的产生,它不仅可以诱导心肌细胞肥大,高浓度时还可诱导心肌细胞凋亡。PrxⅢ（PeroxiredoxinⅢ）是特异性定位于线粒体的硫氧化蛋白依赖的过氧化氢酶,其主要功能是清除线粒体内氧化磷酸化过程中产生的ROS,从而保护免受氧化应激损伤,发挥其抗调亡作用。本实验选取该H9C2细胞为研究对象,利用高浓度NE诱导,观察其凋亡变化,以及在H9C2细胞凋亡中,PrxⅢ的表达变化,以探讨PrxⅢ与H9C2细胞凋亡的相关性。目的建立NE诱导的H9C2细胞凋亡模型,检测PrxⅢ在凋亡H9C2细胞中的表达,为进一步研究NE诱导心肌细胞凋亡的机制和PrxIII的功能奠定基础。方法1 H9C2细胞的培养:含10%FBS、100U/ml双抗的L-DMEM的培养液基,5%CO2、37℃环境下培养。细胞融合至70-80%时,用含0.02%EDTA的胰蛋白酶消化液进行传代。2建立H9C2细胞凋亡模型:H9C2细胞传代24h后,更换无血清培养基继续培养24h后,NE处理组加入含0.5%FBS的培养基后再加入NE至终浓度200μmol/L;NE对照组加入只含0.5%FBS的培养基,放入培养箱中继续培养24小时;正常对照组传代后继续培养48h。3倒置显微镜下观测H9C2细胞形态变化。4透射电镜下观测H9C2细胞超微结构变化。5 Hoechst 33258染色后荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学变化,计数并计算细胞凋亡率。6 MTT法检测细胞活力。7凋亡心肌细胞中PrxⅢmRNA的定量。结果1光镜下观察结果正常对照组和NE对照组细胞呈正常细胞形态。NE处理组可见较多细胞呈现以凋亡为主的典型形态学改变:细胞呈圆形、半贴壁或漂浮状,折光性强,细胞体积缩小,胞膜皱缩、染色质浓缩。2透射电镜下观察结果正常对照组和NE对照组呈正常细胞超微结构:核膜完整,染色质均匀一致。NE处理组表现为细胞核固缩,染色质不均匀,边集;核膜断裂不完整;胞浆浓缩呈囊泡样改变并凸向核膜。3 Hoechst 33258染色后荧光显微镜下观察结果Hoechest 33258染色后在荧光显微镜下观察可见细胞核蓝染,凋亡细胞其细胞核浓染致密颗粒状荧光。计数凋亡细胞后计算,NE处理组细胞凋亡率（0.4167±0.1450）较NE对照组（0.208±0.054）明显增加。4 MTT法测细胞活力NE处理组的细胞存活率（0.294±0.130）较NE对照组（1.644±0.464）明显降低（P<0.05）。5 PrxⅢmRNA的相对表达量的比较NE处理组PrxⅢmRNA相对表达量（0.3121±0.0380）明显高于NE对照组（0.2049±0.0374）（P<0.05）;正常对照组PrxⅢmRNA相对表达量（0.1937±0.0468）与NE对照组相比无明显变化（P>0.05）。结论1本试验证实用200μmol/L的NE作用H9C2细胞24h可抑制心肌细胞生长,诱导心肌细胞凋亡。2在NE诱导的H9C2细胞发生凋亡过程中,随细胞凋亡率的增加,PrxⅢ的表达增高。