鹿茸活性成分的提取及一种新型微胶囊的制备

论文摘要

鹿茸是传统名贵中药,具有温肾壮阳、益精补血、强筋健骨等功效。鹿茸的化学成分比较复杂,含有多种重要的活性物质:如不饱和脂肪酸和溶血卵磷脂等具有降低血压、治疗心血管疾病的作用;对羟基苯甲醛（PHBD）、次黄嘌呤和磷脂等具有抑制单胺氧化酶（ MAO）的作用;雌激素、孕酮等激素对女性更年期综合症有预防和治疗作用;胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-1）和生长激素（GH）可促进生长发育、用来治疗糖尿病、骨质疏松等疾病。现有的鹿茸加工方式比较粗放,产品结构单一,为进一步拓宽鹿茸的市场应用空间,提高其附加值,本课题采用超临界流体萃取技术、超声波强化提取技术和其它蛋白质分离纯化技术,从鹿茸中提取三类功效明确、在临床上具有重要应用价值的活性成分:包括单胺氧化酶抑制剂、天然雌激素和IGF-1等活性多肽。采用动态法实验测定了PHBD在超临界CO2中的溶解度;另外还对利用干酵母（S. cerevisiae）细胞作为囊壁材料制备微胶囊进行了初步研究。首先采用超临界CO2萃取水炸干鹿茸中具有抗衰老作用的单胺氧化酶抑制剂。通过对萃取温度、萃取压力、夹带剂种类和原料粒度的考察,确立最佳萃取工艺条件,提取率可以达到3.58%,萃取物对MAO-B的总抑制活性可以达到3319.13 U/g。萃取物对MAO-B的抑制作用呈明显的量效关系:当萃取物溶液的浓度为278.15 mg/L时,对MAO-B的抑制作用达到93.77%,但对MAO-A的抑制率只有24.18%。利用HPLC、TLC、GC、GC-MS和放射免疫分析等方法对萃取物的化学组成进行分析,萃取物中除含有对MAO有抑制作用的活性成分次黄嘌呤、对羟基苯甲醛和磷脂外,还含有不饱和脂肪酸、谷甾醇、维生素E、甾体化合物、胆固醇、雌二醇、睾酮和孕酮等物质。另外,采用超临界流体萃取和浓缩干鹿茸中的雌激素,雌二醇提取率可以达到0.3342 ng/g鹿茸。萃取物中雌二醇和孕酮含量分别为48.42 ng/g和197.04 ng/g ,有望作为开发成预防和治疗女性更年期综合症产品的原料。采用超声波强化提取鲜鹿茸中的IGF-1。考察了溶液种类和pH、浸提温度、浸提时间、浸提液用量、浸提次数及超声功率等因素的影响。以pH10.0的I号缓冲液作浸提液,IGF-1的提取率可以达到5279.29 ng/g鲜茸。采用超声波强化提取具有提取率高、提取速度快的优点。选用10 kDa的超滤膜,将IGF-1粗提液浓缩6～10倍,IGF-1损失率仅为2.49%,且超滤浓缩速度快。利用无水乙醇去除杂蛋白质的效果最佳,杂蛋白质去除率为91.59%,IGF-1含量提高8.97倍,IGF-1损失率为24.52%。通过阳离子交换层析,总蛋白中IGF-1的含量提高了12.01倍,IGF-1和蛋白质的回收率分别为91.73%和66.85%。进一步通过SDS-PAGE和高效毛细管电泳鉴定,表明鲜鹿茸提取液中含有IGF-1。另外,通过放射免疫分析法检测,鹿茸的IGF-1粗提液中还含有生长激素。以鹿茸冻干粉为原料,首先采用超临界纯CO2萃取鹿茸中的单胺氧化酶抑制剂等脂类活性物质,然后采用溶剂浸提萃余物中IGF-1等活性多肽。结果表明,综合提取鹿茸中的脂类活性物质和IGF-1等多肽是可行性的。利用动态法实验测定了对羟基苯甲醛（PHBD）在超临界CO2中的溶解度,考察改变温度或压力对其溶解度的影响。当温度恒定时,PHBD在超临界CO2中的溶解度随压力增加而增大;PHBD溶解度随温度变化趋势比较复杂。利用溶解度与压力和对比密度两个经验方程进行关联,关联误差在3.67～11%之间,表明这两个方程可用于PHBD在CO2中溶解度的关联。利用PR-EOS计算值较实验结果有较大误差。分别以丁香油和水杨酸甲酯为囊芯,以干酵母细胞作为囊壁材料制备一种新型的微胶囊。通过对包埋温度、芯材比及包埋时间等因素的考察,确定了最佳制备工艺条件,微胶囊中丁香油包埋率可以达到41.26%,而水杨酸甲酯包埋率为48.58%。通过显微镜和电镜观察,微胶囊呈规则的球形,大小均一,直径在2.0～4.0μm之间。这种新型的微胶囊制备方式,具有操作简单、包埋率高、不引入有机溶剂的特点,适合制备药物、食品添加剂等囊芯的微胶囊。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 本课题的主要研究内容:
• 第一部分 鹿茸中活性成分的提取
• 第一章 文献综述
• 1.1 鹿茸的化学成分及药理作用
• 1.1.1 鹿茸的化学成分
• 1.1.1.1 无机元素
• 1.1.1.2 氨基酸和蛋白质
• 1.1.1.3 脂类物质
• 1.1.1.4 神经节苷脂和糖类化合物
• 1.1.1.5 碱基成分和多胺类化合物
• 1.1.1.6 性激素
• 1.1.2 鹿茸的药理作用
• 1.1.2.1 对性功能的影响
• 1.1.2.2 抗炎镇痛和促进创伤愈合功效
• 1.1.2.3 抗衰老和抗疲劳功效
• 1.1.2.4 提高免疫力和对遗传物质的影响
• 1.1.2.5 补血、调节血压及对心肌功能的保护作用
• 1.1.2.6 其他方面的功效
• 1.2 鹿茸产品的开发现状
• 1.3 单胺氧化酶（MAO）与天然单胺氧化酶抑制剂
• 1.3.1 单胺氧化酶
• 1.3.2 天然MAO 抑制剂
• 1.4 雌激素的生理作用与雌激素替代治疗
• 1.4.1 雌激素与心血管疾病
• 1.4.2 雌激素与骨质疏松
• 1.4.3 雌激素的神经保护作用及与阿尔采海默病
• 1.4.4 雌激素与肿瘤
• 1.5 胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-1）的生理功能与临床应用
• 1.5.1 IGF-1 的概况
• 1.5.2 IGF-1 的生理功能
• 1.5.3 IGF-1 的临床应用
• 1.5.3.1 IGF-1 与代谢综合征
• 1.5.3.2 IGF-1 与骨质疏松
• 1.5.3.3 IGF-1 与心脏
• 1.5.3.4 IGF-1 与生长
• 1.5.3.5 IGF-1 对神经系统的保护作用
• 1.5.3.6 IGF-l 与肿瘤
• 1.6 超临界流体萃取
• 1.6.1 基体性质
• 1.6.2 萃取温度
• 1.6.3 萃取压力
• 1.6.4 夹带剂作用
• 1.6.4.1 增大目的溶质在超临界流体的溶解度
• 1.6.4.2 覆盖基体活性位
• 1.6.4.3 基体溶胀作用
• 1.6.4.4 化学衍生作用
• 1.6.5 超临界流体流速、萃取时间
• 1.7 超生波强化提取
• 1.7.1 超声波强化提取技术的原理
• 1.7.2 超声波强化提取技术在中草药活性成分提取中的应用
• 1.7.3 超声提取中应注意的问题
• 1.8 超临界流体相平衡的研究
• 1.8.1 基础理论研究
• 1.8.2 超临界流体/固体的相平衡模型研究
• 1.8.2.1 压缩气体模型
• 1.8.2.2 膨胀液体模型
• 1.8.2.3 半经验关联模型
• 1.8.2.4 计算机模拟
• 1.8.2.5 各种模型之间的比较
• 1.8.3 固体-超临界流体相平衡实验技术
• 1.8.3.1 动态法（流动法）
• 1.8.3.2 静态法（平衡法）
• 2萃取鹿茸中的单胺氧化酶抑制剂'>第二章 超临界CO₂萃取鹿茸中的单胺氧化酶抑制剂
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 材料、试剂及主要仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 超临界流体萃取装置与流程
• 2.1.2.2 单胺氧化酶的活性测定
• 2.1.2.3 Bradford 法测定蛋白质含量
• 2.1.2.4 HPLC 法测定萃取物中对羟基苯甲醛和次黄嘌的含量
• 2.1.2.5 薄层色谱法（TLC）鉴定萃取物中的磷脂
• 2.1.2.6 GC-MS 法分析萃取物中脂溶性成分
• 2.1.2.7 GC 法测定萃取物中胆固醇的含量
• 2.1.2.8 萃取物中性激素含量的测定
• 2.1.3 几个物理量的含义及其计算方法
• 2.2 结果及讨论
• 2.2.1 提取工艺的研究
• 2.2.1.1 正交试验结果分析
• 2.2.1.2 物料粒径单因素试验
• 2.2.1.3 小结
• 2.2.2 萃取物对MAO 抑制活性的评价
• 2.2.3 鹿茸的超临界流体萃取物中化学组成分析
• 2.2.3.1 萃取物中次黄嘌呤和对羟基苯甲醛含量的测定
• 2.2.3.2 萃取物中磷脂组成的鉴定
• 2.2.3.3 GC-MS 法分析萃取物中脂类物质组成
• 2.2.3.4 萃取物中胆固醇含量的测定
• 2.3.3.5 萃取物中性激素含量的测定
• 2.2.3.6 小结
• 2.3 本章总结
• 第三章 超临界流体萃取鹿茸中的雌激素
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 材料、试剂及主要仪器设备
• 3.1.2 超临界流体萃取鹿茸中雌激素的工艺流程
• 3.1.3 萃取物中雌二醇等性激素含量的测定
• 3.1.3.1 供试样品溶液的制备
• 3.1.3.2 雌二醇等性激素的测定步骤
• 3.1.4 萃取物中胆固醇含量的测定
• 3.1.5 本章几个常见的物理量及其含义
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 雌二醇检测方法的评价
• 3.2.2 超临界流体萃取鹿茸中雌二醇的研究
• 3.2.2.1 极差结果分析
• 3.2.2.2 温度的影响
• 3.2.2.3 萃取压力的影响
• 3.2.2.4 夹带剂种类的影响
• 3.2.2.5 浸泡时间的影响
• 3.2.3 正交试验结果验证及不同萃取方法的的比较
• 3.2.4 萃取物中其它性激素含量的测定
• 3.3 本章小结
• 第四章 鹿茸中胰岛素样生长因子-Ⅰ的提取
• 4.1 实验部分
• 4.1.1 实验方案
• 4.1.2 材料、试剂及主要仪器设备
• 4.1.3 实验方法
• 4.1.3.1 溶剂浸提或超声波强化提取鹿茸中IGF-1 的过程
• 4.1.3.2 超滤浓缩操作过程
• 4.1.3.3 离子交换柱层析
• 4.1.3.4 SDS-PAGE 法鉴定鹿茸提取物中的IGF-1
• 4.1.3.5 毛细管电泳法鉴定鹿茸提取物中的IGF-1
• 4.1.3.6 提取液中IGF-1 和生长激素（GH）含量的测定
• 4.1.3.7 Bradford 法测定蛋白质含量
• 4.1.4 本章几个常见物理量及其含义
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 IGF-1 检测方法的评价
• 4.2.1.1 准确度测定
• 4.2.1.2 精密度测定
• 4.2.2 溶剂浸提条件的研究
• 4.2.2.1 提取液种类及pH 对IGF-1 提取率的影响
• 4.2.2.2 浸提温度对IGF-1 提取率的影响
• 4.2.2.3 溶剂用量对IGF-1 提取率的影响
• 4.2.2.4 浸提时间对IGF-1 提取率的影响
• 4.2.2.5 浸提次数对IGF-1 提取率的影响
• 4.2.2.6 溶剂浸提条件总结
• 4.2.3 超声波强化提取鹿茸中IGF-1
• 4.2.3.1 极差分析结果
• 4.2.3.2 溶剂用量的影响
• 4.2.3.3 超声波功率的影响
• 4.2.3.4 提取温度的影响
• 4.1.3.5 提取时间的影响
• 4.2.4 超声波强化提取工艺的单因素延伸试验
• 4.2.4.1 原料中IGF-1 含量比较及正交试验最佳条件的验证
• 4.2.4.2 溶剂用量的影响
• 4.2.4.3 超声波功率的影响
• 4.2.4.4 超声波强化提取次数的影响
• 4.2.5 超声波强化提取与静态溶剂浸提的比较
• 4.2.6 提取物的初步纯化
• 4.2.6.1 超滤浓缩、分级试验
• 4.2.6.2 沉淀除杂试验
• 4.2.6.3 离子交换层析
• 4.2.7 鹿茸提取物中IGF-1 的鉴定
• 4.2.7.1 SDS-PAGE 鉴定结果
• 4.2.7.2 高效毛细管电泳鉴定结果
• 4.2.8 鹿茸提取物中生长激素（GH）含量的测定
• 4.3 本章小结
• 第五章 鹿茸活性成分的综合利用
• 5.1 实验内容
• 5.2 结果与讨论
• 2中溶解度的测定'>第六章 对羟基苯甲醛（PHBD）在超临界CO₂中溶解度的测定
• 6.1 实验部分
• 6.1.1 材料、试剂及主要仪器
• 6.1.2 溶解度测定实验步骤
• 6.1.3 紫外分光光度法测定对羟基苯甲醛的浓度
• 6.1.4 对羟基苯甲醛的性质
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 对羟基苯甲醛溶解度实验结果
• 6.2.2 经验方程关联
• 6.2.2.1 PHBD 溶解度与压力的非线性关系
• 2对比密度的线性关系'>6.2.2.2 PHBD溶解度与CO₂对比密度的线性关系
• 6.2.3 Peng-Robinson 状态方程估算溶解度
• 6.2.3.1 Peng-Ronbison 状态方程计算步骤
• 6.2.3.2 对羟基苯甲醛溶解度计算结果
• 6.3 本章小结
• 第七章 结论和建议
• 7.1 结论
• 7.1.1 超临界流体萃取鹿茸中的单胺氧化酶抑制剂
• 7.1.2 超临界流体萃取鹿茸中的雌激素
• 7.1.3 从鲜鹿茸中提取IGF-1 的研究
• 7.1.4 鹿茸活性成分的综合提取
• 2中溶解度的测定和关联'>7.1.5 对羟基苯甲醛在超临界CO₂中溶解度的测定和关联
• 7.2 本部分的主要创新点
• 7.3 建议
• 第二部分 利用酵母细胞作为囊壁材料制备微胶囊的研究
• 第一章 概述
• 第二章 利用酵母细胞微胶囊化丁香油的研究
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 实验方案
• 2.1.2 材料、试剂及主要仪器
• 2.1.3 丁香油的制备
• 2.1.4 丁香油微胶囊的制备
• 2.1.5 酵母微胶囊形貌的观察
• 2.1.6 丁香油微胶囊挥发度的测定
• 2.1.7 丁香油微胶囊缓释抑菌试验
• 2.2 结果及讨论
• 2.2.1 丁香油微胶囊制备工艺的研究
• 2.2.2 丁香油微胶囊形貌的观察
• 2.2.3 丁香油微胶囊的挥发性试验
• 2.2.4 丁香油微胶囊缓释抑菌试验
• 2.3 本章小结
• 第三章 利用酵母细胞微胶囊化水杨酸甲酯的研究
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 材料、试剂和主要仪器
• 3.1.2 水杨酸甲酯微胶囊的制备过程
• 3.1.3 微胶囊中水杨酸甲酯包埋率的测定
• 3.1.4 微胶囊体外释放度测定
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 酵母细胞微胶囊化水杨酸甲酯的研究
• 3.2.1.1 温度效应
• 3.2.1.2 芯材比效应
• 3.2.1.3 时间效应
• 3.2.2 水杨酸甲酯微胶囊体外释放度
• 3.3 本章小结
• 第四章 结论与建议
• 参考文献
• 第一部分参考文献
• 第二部分参考文献
• 符号说明
• 附录
• 博士期间的科研成果
• 致谢