蓖麻三磷酸甘油脱氢酶（RcGPDH）基因克隆与功能鉴定

论文摘要

蓖麻（Ricinus communis L.）为大戟科蓖麻属一年生或多年生草本植物,其种子含油量可高达60%。蓖麻油的主要成分是羟基化的蓖麻油酸（顺式-12-羟基十八碳-9-烯酸）,其特殊的羟基化结构决定了蓖麻油具有特殊的性能及广泛的工业用途,蓖麻因此而成为重要的工业油源作物,也是世界十大油料作物之一。目前,针对植物种子油累积的分子机制的报道主要研究了参与三酰甘油（TAG）合成的Kennedy途径中相关酰基转移酶的作用,而为Kennedy途径提供甘油骨架的三磷酸甘油脱氢酶（glycerol-3-phosphate dehydrogenase）在TAG合成中的作用一直不太受关注。本研究主要探讨蓖麻三磷酸甘油脱氢酶基因（RcGPDH）在TAG合成上的功能,进而阐明在蓖麻油累积过程中的作用。根据已报道的蓖麻种子表达序列标签（Expressed Sequence Tags, EST）设计引物,通过RACE （rapid-amplification of cDNA ends）方法克隆了蓖麻RcGPDH基因并对其序列及所编码的蛋白质结构进行了分析；荧光定量PCR分析结果表明,该基因在蓖麻种子发育后期有较强的表达。为了研究该基因的功能,构建了该基因的酵母表达载体PYES2.1/V5-His -RcGPDH,转化酵母野生型菌株BY4742,运用分光光度法测定转基因酵母的生长曲线,通过香草醛法测定稳定生长期的转基因酵母的油脂含量；构建了在种子特异表达启动子NAPIN启动下的植物表达载体,并通过遗传转化使其在野生型拟南芥中过量表达。结果表明转基因酵母菌株比转空载体对照菌株生长慢,两者均在培养18小时后进入平台期,但油脂含量及脂肪酸组成没有显著的变化。RcGPDH基因在拟南芥中过量表达使转基因拟南芥的种子油脂含量减少而种子增大,同时,转基因拟南芥饱和脂肪酸减少,而多不饱和脂肪酸增加,由此推测该基因可能与蓖麻适应低温胁迫有关,而对油脂累积没有积极的作用。为了能更全面的研究该基因的功能,同时开展了建立蓖麻遗传转化体系的实验。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 能源植物
• 1.1.1 能源植物
• 1.1.2 能源植物利用
• 1.2 能源植物蓖麻
• 1.2.1 蓖麻简介
• 1.2.2 蓖麻的经济价值
• 1.3 植物中油脂累积的途径
• 1.4 GPDH酶的研究进展
• 1.5 研究目标和技术路线
• 第二章 RcGPDH基因的克隆
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 材料选择
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试验相关溶液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 蓖麻种子总RNA的提取及纯化
• 2.2.2 总RNA质量的检测
• 2.2.3 引物的设计
• 2.2.4 RcGPDH基因的克隆
• 2.2.5 RcGPDH基因的生物信息学分析
• 2.2.6 基因表达模式的分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 蓖麻总RNA的提取
• 2.3.2 RcGPDH基因的克隆及序列分析
• 2.3.3 RcGPDH基因的表达模式分析
• 2.4 小结
• 第三章 RcGPDH基因在酵母中的表达分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料和试剂
• 3.1.2 载体和菌种
• 3.1.3 转化酵母用的培养基
• 3.2 方法
• 3.2.1 酵母表达载体的构建
• 3.2.2 酵母遗传转化
• 3.2.3 转基因酵母的阳性鉴定
• 3.3 RcGPDH基因在酵母中表达的功能分析
• 3.3.1 转基因酵母生长曲线的测定
• 3.3.2 转基因酵母油脂百分含量的测定
• 3.3.3 GC（气相色谱）检测酵母油脂的含量
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 载体构建及酵母转化
• 3.4.2 转基因酵母阳性鉴定
• 3.4.3 转基因酵母的培养与油脂测定
• 3.4.4 转基因酵母和转空载体酵母的油脂检测
• 3.5 小结
• 第四章 RcGPDH基因在拟南芥中的表达分析
• 4.1 材料和方法
• 4.2 结果与分析
• 4.3 小结
• 第五章 蓖麻遗传转化体系的建立
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.1.3 培养条件
• 5.2 结果与分析
• 5.3 讨论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 讨论与展望
• 参考文献
• 硕士期间取得的科研成果
• 致谢