重组蝎毒抗神经兴奋肽纳米粒脑靶向给药系统的研究

论文摘要

重组蝎毒抗神经兴奋肽（ANEP）为来源于蝎毒的多肽类新型基因重组药物,药理实验表明具有良好的抗神经兴奋活性。本文在对ANEP进行可溶性表达与分离纯化的基础上,对ANEP的基本性质进行了系统的研究,并设计以三甲基壳聚糖（TMC）为载体材料制备ANEP纳米粒传递系统（ANEP-TMC/NPs）,以期达到在保证ANEP药效的同时兼有一定脑靶向性作用的目的。在对ANEP进行可溶性表达与分离纯化的工作中,将表达质粒pNJUTRX-1-ANEP-His6转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行实验室规模发酵,ANEP表达量占菌体总蛋白约12%,其中可溶性表达部分占90%以上。应用金属离子螯合层析技术将目的蛋白从菌体中分离纯化,将亲和标签His Tag定位于重组多肽的C端以提高纯化效率。ANEP终产量为3.0 mg每升发酵液,纯度>95%。为建立特异性检测ANEP的方法与手段,本文以纯化后的ANEP作为抗原免疫新西兰白兔,8周后制得ANEP的抗血清,并将所得到的ANEP抗血清通过Protein A SepharoseCL-4B柱层析方法分离纯化得到ANEP抗体,该抗体的活性经western blot方法得到验证。利用制得的ANEP抗体,分别建立并考察间接酶联免疫吸附法（ELISA）和间接竞争ELISA分析方法,最终确定以间接ELISA方法进行ANEP的含量测定,该方法的线性范围为0.025～1.600μg／mL,R2为0.9994。所建立的特异性检测ANEP的间接ELISA方法能够很好的满足ANEP体外测定的要求,该项研究目前尚未见到国内外的有关报道。由编码ANEP的基因序列可知,ANEP为由64个氨基酸组成的药用多肽；经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确证ANEP的分子量为8300 Da；等电聚焦法测得ANEP的等电点为5.2,为偏酸性蛋白；摇瓶法测得ANEP在正辛醇／pH 7.4 PBS中表观分配系数为0.17,为水溶性蛋白。对ANEP的热稳定性、pH值稳定性、冻融稳定性、超声稳定性进行研究,结果表明ANEP的热稳定性良好,在偏酸性环境下易降解,对反复冻融和超声较为敏感。针对ANEP为水溶性蛋白类药物,对外界环境较为敏感易降解的性质特点,采用制备条件温和的离子胶凝法制备包载ANEP的纳米粒,以期获得具有一定脑靶向作用的阳离子纳米粒制剂。首先以壳聚糖为原料,通过甲基化反应制备壳聚糖的衍生物三甲基壳聚糖,采用IR、1HNMR对产物进行结构确证并计算样品的取代度。产物三甲基壳聚糖的水溶性和荷电性较壳聚糖得到了大幅度的提高。在制备载药纳米粒的过程中,以包封率、载药量和粒径为评价指标,在单因素实验的基础上通过正交设计实验优化处方,得到最优处方为：TMC的取代度为36.1%,TMC/TPP （w/w）的比值为4.5,TPP浓度为0.6mg/mL, ANEP投药量为2.0 mg。按照最优处方制备的纳米粒包封率为80.63±2.36%,载药量为185.4±5.4μg／mL,粒径在255±11 nm,Zeta电位为32.0±2.12 mV,制剂的pH值为6.61。对制剂进行稳定性考察,结果表明纳米粒制剂在4℃贮存4周时粒径显著增大,聚集的趋势明显,放置不稳定。为了提高纳米粒的贮存稳定性可将产品做成冻干制剂。经过工艺和处方优选制备了以5%的甘露醇为冻干支持剂的ANEP-TMC／NPs冻干粉。所得冻干产品外观饱满致密,以注射用水复溶后能够保持冻干前的各项理化性质基本不变,且制剂的安全性考察合格。在对纳米粒制剂进行药物动力学和组织分布学研究中,将ANEP用异硫氰酸荧光素（FITC）标记,建立荧光分光光度法作为研究ANEP及ANEP-TMC/NPs体内行为特征的分析手段。对高、中、低三个剂量（20,10,5 mg／kg）的FITC-ANEP的药物动力学实验研究表明,高剂量时药物在大鼠体内可能存在剂量依赖性药动学特征,中、低剂量时则具有线性动力学特征。对FITC-ANEP和FITC-ANEP-TMC/NPs的药动学比较研究表明,制剂组的血药浓度较溶液组平稳且中后期略有提高,制剂组的平均滞留时间（MRT）与溶液组比较稍有延长,但二者无显著性差异（P>0.05）。进行小鼠体内的组织分布研究,静注给药后FITC-ANEP-TMC/NPs和FITC-ANEP在脑组织中的峰浓度比值（Ce值）为2.236,相对于溶液组,纳米粒制剂组ANEP在脑内的分布得到了显著的增加（P<0.01）,表现出了制剂预期的脑靶向作用。通过将载体材料三甲基壳聚糖标记FITC后制备纳米粒对脑靶向机制作进一步的研究探讨,实验表明ANEP-FITC-TMC/NPs能够透过血脑屏障在脑中分布,推测吸附介导的胞吞作用为制剂具有脑靶向的原因,验证了三甲基壳聚糖作为脑靶向制剂载体的可能性。纳米粒制剂相对于ANEP溶液在表现出脑靶向的同时对肝也有着较明显的趋向性。溶液组和制剂组的药物都主要通过肝、肾被代谢清除。载体材料FITC-TMC在血浆中的消除实验表明,FITC-TMC在血中无长期滞留现象,能够被完全消除,该载体材料的生物可降解性较好。

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中文摘要

ABSTRACT

前言

1 蝎与蝎毒

2 神经兴奋类疾病与东亚钳蝎毒抗癫痫肽（AEP）

3 基因重组药物与重组蝎毒抗神经兴奋肽（ANEP）

4 蛋白多肽类药物注射给药系统研究进展

5 脑靶向给药研究进展

6 三甲基壳聚糖做为纳米粒载体材料的选择

7 本论文研究的立题依据及目的

8 本论文的主要研究内容

第一章重组蝎毒抗神经兴奋肽（ANEP）的制备——ANEP的表达和纯化

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法与结果

2.1 ANEP的可溶性表达

6的构建'>2.1.1 表达质粒pNJUTRX-1-ANEP-His₆的构建

2.1.2 转化

2.1.3 含重组质粒的细菌菌落的鉴定

2.1.4 表达可溶性验证

2.1.5 ANEP的实验室规模发酵

2.2 ANEP的分离纯化

2.2.1 金属离子螯合柱层析方法的建立

2.2.2 样品浓缩除盐

2.2.3 蛋白质含量测定——Lowry法（即Folin-酚法）

3 讨论

4 本章小结

第二章重组蝎毒抗神经兴奋肽（ANEP）分析方法的建立

1 材料与仪器

2 方法与结果

2.1 微量二喹啉甲酸（Micro BCA）分析方法的建立

2.1.1 标准曲线的绘制

2.1.2 分析方法的确证

2.2 抗血清的制备

2.2.1 免疫程序及方法

2.2.2 对流免疫电泳法检测抗体的生成

2.3 亲和层析法纯化抗体

2.3.1 原理

2.3.2 凝胶柱的制备

2.3.3 上样

2.3.4 洗脱

2.3.5 测定抗体含量

2.4 Western blot方法确证抗体的特异性

2.4.1 工作液的配制

2.4.2 Western blot检测

2.5 ELISA分析方法的建立

2.5.1 试剂配制

2.5.2 不同ELISA测定方法的选择比较

2.5.3 ELISA法最适条件确定

2.5.4 分析方法的确证

2.5.5 血浆对ELISA测定的干扰

3 讨论

4 本章小结

第三章 ANEP的基本性质和处方前研究

1 材料与仪器

2 方法与结果

2.1 ANEP的基本理化性质

2.1.1 ANEP的基因序列

2.1.2 ANEP的氨基酸序列

2.1.3 ANEP的分子量

2.1.4 ANEP的等电点

2.1.5 ANEP的空间结构

2.1.6 ANEP的紫外吸收光谱

2.1.7 ANEP表观油/水分配系数的测定

2.2 ANEP的初步稳定性研究

2.2.1 热稳定性

2.2.2 pH值稳定性

2.2.3 冻融稳定性

2.2.4 超声稳定性

3 讨论

4 本章小结

第四章 ANEP三甲基壳聚糖纳米粒的制备及性质研究

1 材料与仪器

2 方法与结果

2.1 三甲基壳聚糖的制备

2.1.1 三甲基壳聚糖的合成路线

2.1.2. 三甲基壳聚糖的结构表征

2.1.3 三甲基壳聚糖的溶解性实验

2.2 ANEP-TMC/NPs的制备

2.2.1 制备方法

2.2.2 评价指标

2.2.3 ANEP-TMC/NPs的包封率、载药量和粒径

2.2.4 正交设计

2.2.5 不同甲基化取代度的TMC对纳米粒包封率的影响

2.3 ANEP-TMC/NPs的基本性质

2.3.1 粒径与Zeta电位

2.3.2 外观形态

2.3.3 pH值

2.3.4 包封率与载药量

2.3.5 ANEP在纳米粒中的稳定性

2.3.6 ANEP-TMC/NPs的体外释放

2.3.7 ANEP-TMC/NPs的稳定性考察

2.4 ANEP-TMC/NPs冻干制剂的制备

2.4.1 冻干支持剂的筛选

2.4.2 冻干工艺的考察

2.4.3 ANEP-TMC/NPs冻干制剂的粒径与zeta电位

2.4.4 ANEP-TMC/NPs冻干制剂的包封率

2.4.5 ANEP-TMC/NPs冻干制剂复溶后的稳定性

2.5 制剂初步安全性实验

2.5.1 体外溶血试验

2.5.2 血管刺激性实验

3 讨论

4 本章小结

第五章 ANEP-TMC/NPs的药物动力学和组织分布研究

1 材料与仪器

2 方法与结果

2.1 FITC标记ANEP（FITC-ANEP）的制备

2.2 标准曲线的绘制

2.3 分析方法的确证

2.3.1 精密度

2.3.2 回收率

2.4 ANEP-FITC中FITC含量的确定

2.5 FITC-ANEP-TMC/NPs的制备和性质

2.6 药物动力学研究

2.6.1 血浆样品荧光分析方法的建立

2.6.2 FITC-ANEP在大鼠体内的药物动力学研究

2.6.3 FITC-ANEP-TMC/NPs在大鼠体内的药物动力学研究

2.7 FITC-ANEP及FITC-ANEP-TMC/NPs的组织分布研究

2.7.1 组织样品荧光分析方法的建立

2.7.2 给药方案、组织样品采集及数据处理

2.7.3 FITC-ANEP-TMC/NPs的靶向性评价

2.7.4 FITC-ANEP-TMC/NPs入脑机制的探讨

2.8 FITC-TMC在血液中的消除

3 讨论

4 本章小结

全文结论

参考文献

缩略词注解

致谢

攻读博士学位期间发表论文情况

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