椪柑多倍体的分离以及脐橙品种的遗传多样性分析

论文摘要

体细胞突变是柑橘等果树比较常见的生物学现象，也是品种选育，即芽变选种的主要变异来源。针对柑橘芽变品种较多，识别比较困难，遗传标记差异小等困难，本文采用MSAP（甲基化敏感扩增多态性）等标记技术，对世界主要的甜橙类型脐橙（Citrus sinensis）不同品种进行分析，研究其遗传多样性；同时，利用体细胞的倍性变异以及柑橘具有珠心胚现象的特点，针对椪柑种子多的问题，从椪柑种子离体播种实生苗中分离得到四倍体，为培育三倍体无核类型，改良种子多的性状提供了材料。主要结：果如下： 1、通过组培方法培育椪柑（C. reticulata）多胚苗，从374粒种子中培养得到449株小苗，利用流式细胞仪和染色体记数方法筛选出7株四倍体植株。对获得的7株四倍体植株进行SSR分析，表明这7株四倍体均来自珠心细胞，为体细胞自然加倍得到的同源四倍体。这些同源四倍体植株表现出叶片比二倍体大，叶片鲜样的叶绿素a和类胡萝卜素含量则比二倍体低。结合RAPD、SSR、AFLP分析研究椪柑体细胞加倍发生的变异情况，RAPD、SSR分析没有检测到变异的发生，说明加倍过程很少发生重组。AFLP检测到其中一株四倍体有一条特征带，这可能是椪柑体细胞发生加倍时，核苷酸碱基序列发生改变，或是同源四倍体的等位基因发生漂移。 2、应用RAPD、SSR、AFLP、SRAP、IRAP分子标记研究脐橙24个品种的多态性，RAPD、SSR、IRAP均没有鉴别出脐橙品种之间的遗传差异；AFLP的检测效率也很低，130对引物中仅5对显示品种间的多态性，鉴别出了四个脐橙品种；而36对SRAP引物中也只有一对显示朋娜有一条带缺失。 3、8个Mse Ⅰ／Pst Ⅰ（M／P）引物对和8个EcoR Ⅰ／Hpa Ⅱ、EcoR Ⅰ／Msp Ⅰ（E／H+M）引物对分别得到36个和43个多态性标记，M／P引物对和E／H+M引物对得出的平均多态性比率（Pi）为7.56％和15.19％，平均多态性信息含量分别为0.086和0.249，标记指数分别为0.387和1.070。E／H+M引物对的效率高于M／P引物对的效率。130个EcoR Ⅰ／Mse Ⅰ（E／M）引物对，有5对引物显示有多态性。这5对引物扩增得到318条带，其中有11条多态带，平均多态率为3.46％，平均多态性信息含量（PIC）和标记指数（MI）分别为0.085和0.187，比E／H+M和M／P的都要低，表明E／M引物对的效率比E／H+M和M／P引物对的效率要低很多。 4、利用MSAP（甲基化敏感扩增多态性）技术对24个脐橙品种胞嘧啶甲基化模式和程度进行评估，结果发现DNA甲基化在脐橙中发生频繁，在脐橙基因组CCGG

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1 课题的提出
• 2 前人研究进展
• 2.1 柑橘品种改良进展
• 2.1.1 柑橘选育种目标
• 2.1.2 柑橘遗传多样性的收集和保存
• 2.1.3 柑橘品种改良技术
• 2.1.3.1 芽变选种和实生选种
• 2.1.3.2 计划育种
• 2.2 柑橘多倍体育种与无核品种选育
• 2.2.1 植物多倍体
• 2.2.2 多倍体的产生
• 2.2.3 多倍体的鉴定
• 2.2.4 柑橘多倍体育种
• 2.2.4.1 柑橘多倍体获得途径
• 2.3 柑橘芽变及芽变的检测方法
• 2.3.1 柑橘芽变
• 2.3.2 芽变的检测方法
• 2.3.2.1 形态学观察
• 2.3.2.2 同工酶标记
• 2.3.2.3 DNA分子标记
• 2.3.2.3.1 DNA分子标记的分类
• 2.3.2.3.2 分子标记的应用
• 3 本研究的目的和内容
• 第二章：成熟胚培养获得椪柑自然四倍体
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 组织培养
• 1.2.2 温室实生播种
• 1.2.3 流式细胞仪分析
• 1.2.4 染色体制片
• 1.2.5 DNA的提取
• 1.2.6 RAPD、SSR、AFLP分析
• 1.2.6.1 RAPD分析
• 1.2.6.2 SSR分析
• 1.2.6.2.1 SSR扩增中使用的引物
• 1.2.6.2.2 SSR扩增PCR反应体系
• 1.2.6.2.3 PCR扩增
• 1.2.6.2.4 凝胶电泳
• 1.2.6.3 AFLP分析
• 1.2.7 叶片形态及色素含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 流式细胞仪检测结果
• 2.2 染色体观察结果
• 2.3 RAPD分析结果
• 2.4 SSR分析结果
• 2.5 AFLP分析结果
• 2.6 椪柑二倍体,四倍体叶片一些生理指标的测定结果
• 3 讨论
• 3.1 组织培养分离自然发生的四倍体是获得四倍体植株简单、有效的途径
• 3.2 获得的椪柑同源四倍体可作为三倍体无核育种的原始材料
• 3.3 椪柑发生体细胞加倍的变异研究
• 第三章：利用分子标记技术分析脐橙品种间的遗传差异
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 DNA的提取
• 1.2.2 各种分子标记分析
• 1.2.2.1 RAPD分析
• 1.2.2.2 SSR分析
• 1.2.2.3 AFLP分析
• 1.2.2.4 MSAP分析
• 1.2.2.4.1 Mse Ⅰ／Pst Ⅰ组合
• 1.2.2.4.2 EcoR Ⅰ／Hpa Ⅱ、EcoR Ⅰ／Msp Ⅰ组合
• 1.2.2.5 IRAP分析
• 1.2.2.6 SRAP分析
• 1.2.3 差异片段的回收,T-A克隆及测序
• 1.2.4 RFLP分析
• 1.2.5 数据处理
• 2 结果和分析
• 2.1 几种分子标记的多态性比较
• 2.1.1 MSAP标记的多态性
• 2.1.2 AFLP标记的多态性
• 2.2 脐橙的遗传多态性分析
• 2.2.1 RAPD分析结果
• 2.2.2 SSR分析结果
• 2.2.3 IRAP分析结果
• 2.2.4 SRAP分析结果
• 2.2.5 AFLP分析结果
• 2.2.6 MSAP分析结果
• 2.2.6.1 Mse Ⅰ／Pst Ⅰ（M／P）分析结果
• 2.2.6.2 EcoR Ⅰ／Hpa Ⅱ和EcoR Ⅰ／Msp Ⅰ分析结果
• 2.2.7 脐橙品种的多态性比率
• 2.2.8 特征带的分布
• 2.3 脐橙甲基化多态性分析
• 2.4 脐橙甲基化模式
• 2.5 同一品种不同器官的DNA甲基化分析结果
• 2.6 片段测序结果
• 2.7 RFLP分析结果
• 3 讨论
• 3.1 分子标记在脐橙品种间多态性检测上的应用评价
• 3.2 不同酶切的AFLP标记的比较
• 3.3 脐橙品种胞嘧啶甲基化现象的初步研究
• 3.3 DNA甲基化与脐橙芽变
• 参考文献
• 图版及说明
• 致谢
• 在读期间发表的文章