论文摘要
目的：比较两种大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的体外分离纯化方法，并初步鉴定MSCs的生物特性，为进一步研究其分化调控机制和应用打下基础。方法：本研究分别利用人淋巴细胞分离液进行梯度密度离心法和全骨髓接种法对大鼠骨髓MSCs进行分离、纯化，并对这两种方法进行比较；比较MSCs的两种体外标记法：绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转染法和Hoechst 33342标记法；比较不同培养代数(10代以内与50代以上)大鼠骨髓MSCs表面抗原CD45、CD44、CD29、细胞周期、染色体核型，并且用成脂、成骨诱导液分别对不同培养代数的MSCs进行体外诱导，观察其CD抗原变化并进行细胞染色，从而对MSCs的生物特性进行初步鉴定；对标记的大鼠骨髓MSCs进行成脂、成骨诱导，观察标记是否影响其分化。另外，用Hoechst 33342标记的大鼠骨髓MSCs(剂量为：10~6个细胞／只)分别对大鼠进行全身注射、腹腔和腹股沟接种，对MSCs体内接种的安全性进行初步试验。结果：与梯度密度离心法相比，全骨髓接种法所获取的MSCs数量较多，细胞生长速度较快，操作简单、省时。用GFP标记的MSCs，其标记率只有约20％，经G418筛选后，转染上GFP基因的MSCs，其荧光强度不随时间的延长而减弱，但停止了增殖和分化；而用Hoechst 33342标记的MSCs，其标记率为100％，被标记的MSCs仍可以继续增殖生长，但随着分裂代数的增多，荧光强度逐渐变弱。10代以内的大鼠骨髓MSCs的表面抗原CD45阳性率为6.86％、CD44阳性率为14.91％、CD29阳性率为97.89％，用流式细胞仪测定其细胞周期，有76.41％的细胞处于G0／G1期，13.27％的细胞处于S期，10.33％的细胞处于G2／M期，染色体数目为2n=42条，G带显示清晰；长期传代(50代以上)大鼠骨髓MSCs的表面抗原CD45阳性率为4.35％、CD44阳性率为59.65％、CD29阳性率为99.18％，用流式细胞仪测定其细胞周期，有57.86％的细胞处于G0／G1期，23.81％的细胞处于S期，18.33％的细胞处于G2／M期，染色体数目为43条，比正常染色体数目多一条，G带显示清晰。用成脂、成骨诱导液分别诱导10代以内、长期传代和标记了Hoechst 33342的大鼠骨髓MSCs，均可形成脂肪滴，用油红O染色后，脂肪滴为红色，用碱性磷酸酶底物BCIP／NBT染色后，细胞质显示紫蓝色；10代以内和长期传代大鼠骨髓MSCs诱导后，其表面抗原CD44阳性率均高于诱导前，10代以内大鼠骨髓MSCs诱导后，其表面抗原CD45、CD29阳性率均比诱导前稍高。体内接种实验未见大鼠发生免疫排斥反应，也未发现有肿瘤、畸胎瘤和Hoechst 33342标记的细胞。结论：本实验分离纯化所得到的细胞确实为大鼠骨髓MSCs；用Hoechst 33342标记MSCs并不影响其增殖和分化；将其接种到体内不会产生肿瘤和畸胎瘤，具有一定的安全性，为进一步研究其应用提供了依据。