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白氏文昌鱼BAC文库的构建及Pax基因家族的进化分析

2020-11-23阅读(893)

白氏文昌鱼BAC文库的构建及Pax基因家族的进化分析

论文摘要

文昌鱼是现存生物中最近似于脊椎动物直接祖先的一个类群,在动物进化史上占据了极其重要的地位,是进化生物学、比较基因组学和发育生物学等研究的重要生物模式。白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)分布于西太平洋沿岸的浅海沙滩,是目前世界上研究较多的几种文昌鱼之一。本研究在系统地摸索并优化了文库构建过程中几个关键技术环节的基础上,构建了国内外第一个白氏文昌鱼细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome, BAC)基因组文库。该文库由45,312个克隆组成,存放于118块384孔板中。通过对随机挑取318个的克隆进行脉冲场凝胶电泳检测,估算出文库克隆平均插入片断为120 kb,相当于文昌鱼基因组大小的12倍,从文库中获得任意目的片断的概率高达99.9995 %。我们采用二轮PCR的方法对4个单拷贝的文昌鱼Pax基因进行筛选,共获得24个阳性克隆,平均每个基因对应6个克隆。结果显示这个文昌鱼的文库质量较高,将成为比较基因组研究的宝贵的资源,为进一步研究脊椎动物的基因组进化奠定了一定的基础,Pax基因编码一组胚胎发育过程中起重要作用的转录因子。为了研究该基因家族的进化历史,本研究将含有Pax基因的4个阳性BAC克隆进行测序,共得到474 kb序列。分析结果表明四个白氏文昌鱼的Pax基因BbPax1/9、BbPax2/5/8、BbPax3/7和BbPax6分别跨越了15.9 kb、68.1 kb、13.1 kb和38.2 kb的基因组序列,包含外显子数目分别为5、9、5和11,编码氨基酸长度分别为363、444、470和461氨基酸。与佛罗里达文昌鱼的同源基因相比较,氨基酸水平上的同源性97.2 %、98.9 %、70.1 %和97.0 %,内含子位置完全一致。结合17个物种的基因组序列的检索和GenBank中已有cDNA的同源性搜索,本研究从数据库中收集了Pax基因家族成员的序列并对其基因结构进行了注释。对4个文昌鱼Pax基因所属的4个亚家族分别进行比较分析,结果显示:1.四个亚家族的复制都发生在脊椎动物分化早期。其中Pax1/9、Pax2/5/8和Pax3/7的进化历史在系统树中得到了清

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第一章 文献综述
  • 一 基因组文库的构建和应用研究进展
  • 1 基因组文库的产生和发展
  • 2 细菌人工染色体文库的构建、保存和鉴定
  • 3 细菌人工染色体文库的应用
  • 二 文昌鱼分子生物学研究进展
  • 1 文昌鱼在系统发生中的地位
  • 2 利用发育调控基因识别文昌鱼和脊椎动物之间身体结构同源性
  • 3 文昌鱼特异的基因倍增
  • 4 文昌鱼比较基因组学研究
  • 5 现有的文昌鱼基因组资源
  • 三 Pax 基因家族研究进展
  • 1 Pax 蛋白的结构
  • 2 Pax 基因的表达
  • 3 Pax 基因与与肿瘤发生的关系
  • 4 Pax 基因突变与疾病的关系
  • 5 与Pax 基因相关的非编码区保守序列
  • 四 论文的选题和目的
  • 参考文献
  • 第二章 白氏文昌鱼细菌人工染色体文库的构建
  • 一 材料和方法
  • 1. 材料
  • 1.1 文昌鱼
  • 1.2 菌株与质粒
  • 1.3 主要试剂
  • 1.4 主要仪器
  • 2. 方法
  • 2.1 高分子量（HMW）基因组DNA 的抽提
  • 2.2 部分酶切和大片断DNA 的回收
  • 2.3 电击感受态制备
  • 2.4 连接与转化
  • 2.5 重组克隆插入片断大小的鉴定
  • 2.6 单克隆分离和培养
  • 2.7 BAC 文库的筛选
  • 二 结果
  • 1 洗涤缓冲液的选择
  • 2 预电泳效果
  • 3 部分酶切条件的选择
  • 4 片断选择
  • 5 连接与转化
  • 6 外源DNA 的选择
  • 7 文库的建立
  • 8 文库的鉴定
  • 9 PCR 法从BAC 文库中筛选含Pax 基因的阳性克隆
  • 三 讨论
  • 1 大片断DNA 的提取方法的改进
  • 2 连接的比例和浓度
  • 3 文库的质量
  • 4 文库的筛选
  • 参考文献
  • 第三章 Pax 基因家族系统进化分析
  • 一 材料与方法
  • 1 BAC 克隆的测序
  • 2 文昌鱼BAC 克隆含有基因的预测
  • 3 Pax 基因的比较分析
  • 二 结果
  • 1 包含Pax 基因的BAC 克隆的测序结果
  • 2 Pax1/9 亚基因家族的序列与结构比较
  • 3 Pax2/5/8 亚家族基因的序列与结构比较
  • 4 Pax3/7 亚基因家族的序列与结构比较
  • 5 Pax4/6 亚基因家族的序列与结构比较
  • 6 海胆和文昌鱼中非典型Pax 基因的发现
  • 7 Pax 亚家族的四簇聚类定位分析
  • 8 Pax 基因家族的系统发生关系
  • 三 讨论
  • 1 Pax4/6 亚家族倍增时间
  • 2 Pax 亚家族基因结构的进化
  • 3 文昌鱼比海鞘更接近于脊椎动物的直接共同祖先
  • 4 Pax 基因家族的演化
  • 参考文献
  • 第四章 Pax1/9 相关的旁系同源域和非编码区保守域的鉴定
  • 一 材料与方法
  • 1 识别与Pax 连锁的旁系同源基因
  • 2 脊椎动物和非脊椎动物同源基因组序列间比较
  • 二 结果
  • 1. 脊椎动物中Pax1/9 相关的旁系同源域
  • 2. 非脊椎动物中同源基因的连锁
  • 3 连锁同源基因的系统进化分析
  • 4. 非编码保守域的发现
  • 三 讨论
  • 1 含Pax1/9 基因的同线型区域的进化
  • 2 Pax1/9 基因座的非编码保守序列
  • 参考文献
  • 结 论
  • 博士期间发表论文
  • 致谢

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