论文摘要
目的建立分子信标荧光定量PCR快速检测结核杆菌方法，为临床结核病的诊断提供特异性强、灵敏度高、可标准化、自动化的检测方法；评价分子信标荧光定量PCR法在检测临床标本中的应用价值；评估分子信标荧光定量PCR法用于监控抗结核治疗的可行性；应用所建立方法开发检测试剂盒。方法1．分子信标与引物的设计与合成查阅文献，选择适合结核分枝杆菌复合群检测的靶基因。在GenBank数据库中查询靶基因序列，找出高度保守的区段。遵循分子信标与引物设计的规则，设计探针与引物并提交公司合成。对新合成的探针与引物进行筛选与反应性确认。选择结核分枝杆菌基因组DNA的最佳提取方法。2．分子信标检测结核分枝杆菌方法的建立与评价1)分别优化荧光定量PCR反应的退火温度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、PCR Buffer浓度、循环参数等条件，建立荧光定量PCR方法。2)方法评价：特异性：用已建立方法分别检测10株标准菌株与150株临床分离结核分枝杆菌。灵敏度：以结核分枝杆菌H37Ra为试验菌株，对模板DNA 10倍梯度稀释，分析方法的最低检出拷贝数。抗干扰性：接种2支菌量相当（约105cfu）的结核分枝杆菌，其中一支加入菌量远大于结核分枝杆菌的其他杂菌，提取模板DNA分别用已建立方法检测。重复性：用已建立方法重复3次测定同一浓度的模板DNA。3．分子信标检测结核分枝杆菌方法的应用与产品开发评估采集临床疑似结核病人痰标本，分别采用抗酸染色、集菌培养和荧光定量PCR方法进行检测，分析三种方法有无显著差异性，比较三种方法的检出率。对已建立方法进行成本分析，评估开发检测试剂盒的前景。结果1．根据结核分枝杆菌插入序列IS6110基因设计了2对探针与引物，选择特异性最强的一对引物与探针建立荧光定量PCR方法。引物与探针序列如下：引物：5’-GTCGCCCGTCTACTTGGTG-3’5’-GCGGATTCTTCGGTCGTG-3’探针：5’FAM-CCGACGGTGCGTAAGTGGGTGCGTCGG-DABCYL-3’2．热裂解法提取结核分枝杆菌基因组DNA的前处理方法简便、快速、提取效率高。3．最佳PCR反应体系和循环参数（40循环）如下：预变性：94℃3min；变性：94℃20s；退火：52℃20s；延伸：72℃20s。4．分子信标荧光定量PCR方法仅对结核分枝杆菌复合群有扩增，检测灵敏度为103Copies／ml，加入其他分枝杆菌等杂菌对检测没有影响，多次重复试验结果一致。5．分子信标荧光定量PCR方法检测272份临床疑似结核病人痰液标本，阳性182份，检出率为66.91％，远高于抗酸染色（10.75％）和集菌培养法（43.01％）。结论首次建立以分子信标为基础的结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法，方法的特异性强、灵敏度高、抗干扰能力强，能实现结核分枝杆菌的快速检测，可作为结核病常规诊断方法的补充，有利于结核病的早诊断、早治疗，提高结核病的检出率。