新型分泌蛋白AKR1B10的分泌机制及其在乳腺癌分子诊断中的应用研究

论文摘要

醛酮还原酶家族1成员B10（Aldo-keto Reductase family 1, member B10, AKR1B10）,也叫醛糖还原酶相似蛋白1 （Aldo-keto Reductase Like-Protein, ARL-1）主要表达于正常人的结肠和小肠组织,而在肝、胸腺、前列腺、睾丸和骨骼肌等组织中表达低。AKR1B1O一方面还原醛酮类羰基化合物为相应的醇类,保护DNA免于羰基毒性损伤和细胞免于癌变；另一方面AKR1B10稳定乙酰辅酶A羧化酶α（Acetyl-CoA Carboxylase, ACCα）,阻止ACCα降解,从而调节脂质合成,促进肿瘤细胞生长增值。因此,AKR1B10与肿瘤的发生发展密切相关。AKR1B10在肝癌、肺癌、子宫颈癌等多种肿瘤细胞中高表达,是吸烟导致的非小细胞型肺癌的病理学诊断标记物。在本课题中,利用自行开发的ELISA检测法（.已申请专利保护：US13/017,618）,我们发现AKR1B10可从肿瘤细胞内分泌到细胞外。这种分泌现象不但发生在肠癌细胞株HCT-8、HT29,肺癌细胞株H460、A549,乳腺癌细胞株MDA-MB-468, BT-20,肝癌细胞株HepG2等表达内源性AKR1B0的肿瘤细胞株和转染外源性AKR1B10基因的MCF-7乳腺癌细胞株。血清可刺激细胞分泌AKR1B10,而且与透析过的血清相比,平台期的高度无明显变化,但达到平台期的时间更短；这提示血清小分子（离子）决定了分泌的速度,而血清大分子决定了分泌的峰值。AKR1B10的分泌量与细胞数目正相关,但单位细胞分泌量与细胞密度负相关。分泌的AKR1B10仍然保留着与等量纯蛋白酶同样的活性。本课题还深入研究了AKRlB10分泌的机制。通过信号肽分析软件,我们发现AKR1B10的氨基酸序列缺少分泌信号肽,所以推测AKR1B10并不能通过经典的内质网-高尔基（ER-to-Golgi）分泌途径分泌到细胞外的。AKR1B10的分泌不受蛋白翻译抑制剂Cycloheximide（CHX）和ER-to-Golgi分泌途径抑制剂Brefeldin A的影响,说明分泌的AKR1B10是已经合成的,而与正在翻译合成的AKRlB10无关,也与ER到Golgi体之间的转运无关。因此,AKR1B10的分泌途径是非ER-to-Golgi依赖的非经典途径。溶酶体介导的分泌途径是常见的非经典分泌途径。为了论证AKR1B10是否也是通过溶酶体途径分泌的,我们分离了HCT-8细胞的溶酶体,发现AKR1B10存在溶酶体中；用荧光蛋白保护分析法发现,细胞被打孔剂Digitonin和胰蛋白酶（Trypsin）处理后,胞浆内绝大部分带绿色荧光（EGFP）标记的游离AKR1B10被消化掉了,而剩下的点状EGFP-AKR1B10可与溶酶体共定位。这说明AKR1B10存在于溶酶体。为了进一步论证AKR1B10的分泌与分泌型溶酶体出胞的关系,我们用影响溶酶体出胞的因素如温度、ATP、钙离子（Ca2+）等处理HCT-8细胞,发现温度越高,AKR1B10分泌越多,温度越低,分泌越少,4℃时,分泌几乎停止；提供能量的ATP能促进AKR1B10分泌；增加培养基中Ca2+浓度也可促进AKR1B10的分泌,Ca2+跨膜转运体Ionomycin则显著地促进了AKR1B10的释放。趋溶酶体药氯化氨（NH4C1）一方面可促进溶酶体出胞,另一方面可阻止蛋白进入溶酶体；因此,用N-H4C1预处理HCT-8细胞后,AKR1B10分泌减少了；而未预处理组,NH4Cl促进了AKR1B10的分泌。同时,我们发现AKR1B10的释放与溶酶体标记物Cathepsin D的释放规律是一致的,这提示AKR1B10是通过溶酶体介导的非经典途径分泌的。分泌性溶酶体的出胞受调节细胞内Ca2+浓度的信号通路所调节。AKR1B10的分泌受到这些通路中关键信号分子ADP核糖基化因子（ADP-ribosylation factor, ARF）抑制剂Exo-1、磷脂酶C（phospholipase C, PLC）抑制剂U73122的抑制,受G蛋白激动剂GTPγS、G蛋白偶联受体配体fMLP的刺激。进一步证明了AKR1B10的分泌是通过分泌性溶酶体的出胞介导的。本课题接着探讨了AKR1B10进入溶酶体的机制。我们用ATP结合盒超家族转运蛋白（ATP-Binding cassette, ABC）的抑制剂4,4’-diisothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonic acid （DIDS）和Glibenclamide（Glib）处理HCT-8细胞后,发现溶酶体内AKR1B10含量显著减少,分泌到细胞外的AKR1B10也相应减少。提示溶酶体膜上ABC转运体是转运AKR1B10进入溶酶体的主要通道。本课题还证实了AKR1B10在体内也是分泌蛋白。因为AKR1B10主要表达于肠道上皮,因此我们收集了11例正常人的回肠液,检测了其中AKR1B10浓度,发现AKR1B10特异性表达于成熟的肠道上皮细胞,并分泌到肠腔,浓度为188.6～535.7ng/ml （average=298.1ng/ml, n=11）。本课题进一步探讨了主要分布于胞浆的AKR1B10转运到溶酶体的机制。用免疫共沉淀（CoIP）和Pulldown法发现热休克蛋白90a（Heat Shock Protein 90 alpha, HSP90a）可与AKR1B10相互作用。HSP90α抑制剂Geldanamycin （GA）显著地抑制了HCT-8细胞AKR1B10的分泌,降低了HSP90α与AKR1B1O的结合,减少了AKRlB10在溶酶体内的聚集。非经典分泌蛋白通常包含一个与分泌相关的功能域。因此,我们研究了不同AKR1B10肽段的分泌效率,以及它们与HSP90α的结合情况。通过构建AKR1B10全长和不同肽段（N端的N1-39、N1-83、N1-142、N1-231以及C端的C204-261、C204-316）的表达载体GST/pGEX,并将它们分别转染到293T细胞中；与全长AKR1B10的分泌效率相比,N端肽段（N1-231）不具有分泌功能；而C端肽段C204-261、C204-316的相对分泌效率可达74.2±3.0%和81.54±5.5%。这提示介导AKR1B10分泌的功能域可能存在于C端肽段C204-261。接着,我们将螺旋10（氨基酸残基233到240）上氨基酸残基233K、236E和240K三个位点进行了单点或联合突变；与野生型AKR1B10相比,233K/A、236E/A和240K/A单点突变型AKR1B10的分泌效率分别下降到59.2±2.1%、63.3±1.1%和46.9±3.1%；而两点联合突变型AKR1B10的分泌效率减少到了43.15±1.5%（K233A和E236A联合突变）、33.30±1%（K233A和K240A联合突变）和33.52±3.1%（E236A和K240A联合突变）；三点突变型AKR1B10的分泌效率只有野生型的18.24±3.2%。免疫共沉淀实验显示,三点突变性AKR1B10丧失了结合HSP90α的能力；western blot分析表明,突变性AKR1B10在溶酶体内的聚集显著减少了。这些结果提示,螺旋10（aa233-240）通过与HSP90α结合从而介导了AKR1B10的分泌；该螺旋中氨基酸位点233K、236E和240K是结合HSP90α的关键位点。最近,我们研究发现,AKR1B10在乳腺癌组织中过表达,可增加乳腺癌细胞的脂质合成,促进生长增值,抑制醛酮类羰基化合物诱导的凋亡；AKR1B10高表达与乳腺癌的生长、淋巴结转移和存活率相关,提示AKR1B10是一个新的乳腺癌预测指标。因此,本课题探讨了开发AKR1B10为诊断乳腺癌的血清学指标的可行性。通过对乳腺癌组织芯片进行免疫染色发现,正常乳腺小叶和乳腺管低表达或不表达AKR1B10；而在28例原位乳腺管癌中,有20例（71.4%）AKR1B10高表达；在220例乳腺浸润癌中有184（83.6%）AKR1B10高表达；在32例术后复发乳腺癌中有28例AKR1B10高表达。此外,我们检测了50例乳腺癌患者肿瘤组织中AKR1B10的表达和血液中AKR1B10的含量,发现48例乳腺癌组织中的AKR1B10表达水平要显著高于癌旁正常组织的；血清中AKR1B10的平均浓度为20.72ng/ml,显著高于正常人群的5.19ng/ml；乳腺癌患者血清AKR1B10的浓度与肿瘤组织中AKR1B10的表达水平呈正相关。提示AKR1B10可作为诊断乳腺癌的血清分子标记物。总之,AKR1B10可通过HSP90α介导的溶酶体途径分泌到细胞外；AKR1B10可开发为诊断乳腺癌的血清学标记物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词对照表
• 前言
• 第一部分 AKR1B10的分泌途径
• 第一节 材料和方法
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 统计分析
• 第二节 结果
• 1 检测AKR1B10的Sandwich ELISA法的建立
• 2. AKR1B10分泌到细胞外培养基中
• 3. AKR1B10通过非经典途径分泌
• 4. AKR1B10通过溶酶体非经典途径分泌
• 5. AKR1B10的分泌受调节溶酶体出胞的相关因子调节
• 6. 调节AKR1B10分泌的信号通路
• 7. AKR1B10通过ABC转运体进入溶酶体内
• 8. AKR1B10在成熟的肠上皮细胞中的特异性表达和分泌
• 第三节 讨论
• 小结
• 第二部分 HSP90α介导AKR1B10的分泌
• 第一节 材料和方法
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 统计分析
• 第二节 结果
• 1. AKR1B10与HSP90α的相互作用
• 2. HSP90α对AKR1B10分泌的影响
• 3. HSP90α转运AKR1B10到溶酶体
• 4. AKR1B10螺旋10介导了AKR1B10分泌及其与HSP90α的结合
• 第三节 讨论
• 小结
• 第三部分 AKR1B10在乳腺癌分子诊断中的应用研究
• 第一节 材料和方法
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 统计分析
• 第二节 结果
• 1. 组织芯片显示AKR1B10在乳腺癌组织中高表达
• 2. 免疫印迹法检测乳腺癌患者肿瘤组织中AKR1B10的表达
• 3. 正常人群和乳腺癌患者血清AKR1B10的浓度
• 第三节 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 文献综述（一）
• 参考文献
• 文献综述（二）
• Referencees
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果