论文摘要
毛发具有调节体温、排泄代谢物、缓冲外界机械压力等重要生理功能,对人类而言同时还有美学、装扮、特征辨认等社会学意义。因毛囊异常生长所致的多毛或少毛现象不仅会影响毛发生理功能的正常发挥而且正在或可能将要给越来越多的患者造成心理压力,直接影响他们的健康和生活质量。研究表明,毛乳头细胞（dermal papilla cells, DPCs）为位于毛囊基底部的含血管和神经的间充质成分,在毛囊胚胎发育和周期性生长调控中起主导作用。诱导毛囊形成和凝集性生长是毛乳头细胞最为显著的功能特征。毛乳头细胞功能的异常是导致毛囊疾病的主要因素之一。了解毛囊生长的确切机制、调控原理及探讨临床诊治毛囊疾病的方法与措施是毛囊研究领域的重要课题。同时,对毛乳头细胞的生物学功能进行研究也可为毛囊外组织和器官干细胞组织工程提供理论基础。细胞在不同的生物学功能状态下表达的基因不同,基因表达的多样性、有序性、选择性是细胞功能变化的内在根据。因此,分析不同生长状态下毛乳头细胞基因表达的情况,是了解毛乳头细胞特性及毛囊疾病的基础。毛囊具有自我更新和周期性生长的特性。完整的毛囊生长周期包括生长期（anagen）、退行期（catagen）、休止期（telogen）。毛乳头细胞是组成毛乳头的唯一细胞,在毛囊的胚胎发生和周期性生长过程中起重要作用,一方面提供毛囊生长和分化必需的信号因子和营养支持,另一方面还决定毛囊的分化方向。毛乳头是一个可诱导的结构,它能发送或接受信号,从而影响毛囊的发育和周期性生长。通过对小鼠/大鼠模型的研究,一些与毛囊生长周期有关的调节分子如成纤维细胞生长因子（fibobalast growth factors,FGFs）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）、刺猬蛋白（sonic hedgehog,Shh）、神经营养因子（neurotrophins）、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor,PDGF）等已相继被鉴定出来。组成毛囊的细胞如毛乳头细胞、外根鞘细胞（out root sheath,ORS）、毛母质细胞等可分泌这些生长因子及其受体;而且就单一细胞因子而言,其产生和分泌都与毛囊周期的特定时相有关。但是,关于这些细胞因子调节毛囊胚胎发生和毛囊生长周期的具体分子机制如通过什么信号转导途径、与什么分子作用等尚不十分清楚。造血干细胞（hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC）相关基因HSPC016是我国复旦大学学者在人造血干细胞中发现的新基因,宋志强博士等使用抑制性消减杂交技术对凝集性生长的毛乳头细胞及非凝集性生长状态下毛乳头细胞mRNA的表达差异进行了研究,成功建立了毛乳头细胞差异表达基因cDNA文库,为进一步研究毛乳头细胞功能调控的分子机制奠定了基础。我科既往研究发现HSPC016基因作为上调表达基因在凝集性生长状态下人毛乳头细胞差异表达基因cDNA文库中表达并提示HSPC016基因在毛乳头细胞生物学功能调控中有一定的作用。尚不能确定其具体的功能或调控途径。基于以上认识,本课题拟对HSPC016基因在不同生长状态下人毛乳头细胞中表达的生物学意义进行实验研究。1. HSPC016基因的表达和纯化主要实验方法:按Genbank公布的HSPC016核酸序列,根据引物设计原则设计引物,选择合适的PCR反应条件扩增。T-A克隆后构建原核表达质粒,经测序鉴定后转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达、免疫家兔。经镍离子亲和层析纯化法纯化目的蛋白并对重组蛋白HSPC016进行鉴定。实验结果显示PCR法扩增得到了目的基因片段,片段大小约195bp与预期相符;原核表达质粒pET-22b（+）/HSPC016经酶切及测序鉴定与GenBank公布的序列完全一致;转化E.coli BL21（DE3）后经IPTG诱导,HSPC016重组蛋白的表达率约为28%;破菌上清经SDS-PAGE鉴定表明,蛋白以可溶形式表达;以镍离子亲和层析纯化后纯度>95%;免疫家兔获得了效价相对较高的免多抗血清,双扩及ELISA效价分别为1:16和1: 320,000 EU,免疫反应性好。2. McAb-HSPC016制备及特性分析方法单克隆抗体的制备参照传统杂交瘤技术方法进行,将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与HSPC016免疫的Balb/c小鼠的脾脏B淋巴细胞在聚乙二醇（PEG）作用下进行细胞融合,ELISA法筛选出稳定分泌抗HSPC016单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水以获得大量单克隆抗体,并对其亚类及轻链型等进行鉴定。SDS-PAGE鉴定IgG纯度>78.3%,ELISA法检测腹水效价,间接ELISA法测定抗体的亲和常数,Western blotting鉴定单克隆抗体特异性。结果获得1株能稳定分泌抗HSPC016抗体的单克隆杂交瘤细胞株A7B7D7,注入小鼠腹腔后,成功诱生大量腹水;杂交瘤单克隆细胞株A7B7D7分泌的单克隆抗体属于IgG12a,轻链为к型;亲和常数Ka为4.313×1010 （mol/L）-1;Western blotting结果表明,单抗A7B7D7能与人毛乳头细胞中HSPC016形成单一的蛋白质显色条带。3. HSPC016蛋白部分生物学特性分析方法用辣根过氧化物酶HRP标记HSPC016,建立定量检测人HSPC016的含量方法,并初步应用到正常人和秃发患者血清HSPC016的检测。以我科建立的“二步酶”法分离毛乳头,传代培养至第10代,消化对数期生长的第3代和第9代DPCs,调整细胞浓度为3×105细胞/mL,接种于24孔细胞培养板,至对数生长期加入0.1mg/mL的HSPC016重组蛋白继续培养,于倒置显微镜下观察;同时,一组细胞采用流式细胞仪进行检测,另一组细胞内加入3H-TdR继续孵育6h,消化收集细胞,检测HSPC016重组蛋白对DPCs增殖的影响/作用。结果竞争法检测结果初步显示正常人血清中HSPC016的含量大于秃发患者（P<0.01）。显微镜下观察经HSPC016重组蛋白处理过的DPCs增殖较活跃,生长状态好于对照组;流式细胞仪分析和3H-TdR检测结果证实HSPC016重组蛋白能促进第9代DPCs的增殖及其DNA合成,而对第3代DPCs则无明显作用。本实验构建的人HSPC016原核表达载体在大肠杆菌中得到了正确高效地表达,并获得纯度较高的目的蛋白。以淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术制备了抗人HSPC016鼠源性单克隆抗体。该单克隆抗体可用Western blotting等方法对细胞和组织中的HSPC016蛋白进行特异性检测。利用抗人HSPC016单克隆抗体通过竞争法初步检测出正常人和秃发患者血清中HSPC016分布存在着差异。利用我科建立的“二步酶”法从人头皮组织中成功分离出了DPCs,在体外传代培养并用流式细胞仪和同位素标记法大致分析了HSPC016重组蛋白在DPCs增殖中的作用,实验结果表明HSPC016重组蛋白对高传代DPCs的增殖有促进作用。