家蚕气味结合蛋白基因的研究

论文摘要

家蚕是和人们的生产、生活联系最密切的昆虫,是目前唯一完成全基因组测序的鳞翅目昆虫,是国际鳞翅目学会公认的鳞翅目模式生物;数十年来,蚕蛾还一直是研究蛾类嗅觉接受和传导的模式昆虫,其中气味结合蛋白（以性信息素结合蛋白为主）是研究的热点之一。气味结合蛋白（Odorant binding proteins,OBPs）在昆虫和外界环境化学信息交流过程中起着重要作用,对昆虫觅食、求偶、繁殖具有重要意义。因此,开展家蚕气味结合蛋白的研究对进一步认识其功能,阐明家蚕的嗅觉机制,以及利用昆虫嗅觉进行害虫治理和益虫饲养具有重要理论和实践意义。为此,本文利用生物信息学、基因定位、基因表达谱分析、基因克隆、RNAi、分子进化分析和分子标记等方法研究了家蚕气味结合蛋白基因家族的基因结构、定位、表达谱、功能,以及家蚕对人工饲料摄食性相关的分子标记。主要结果如下:1对NCBI公布的家蚕OBPs家族生物信息学分析发现,该家族基因分布于7条染色体上,形成4个基因簇;基因的结构多态性明显,核苷酸序列相似性、遗传距离差距较大;家蚕OBP基因的电子表达谱广,多个基因在多种组织中具有表达。对OBP家族蛋白质分析发现,该家族的生化特性和昆虫OBP蛋白基本类似,其中可能有2个蛋白为跨膜蛋白,5个膜相关蛋白,蛋白质的疏水性区域类似;序列一致性较低,遗传距离差异大,但半胱氨酸和色氨酸非常保守;家蚕的OBP家族同样存在Minus-C类群,但未发现Plus-C类群基因。结果表明,OBP家族可能具有多种功能。2性信息素结合蛋白/普通气味结合蛋白（Pheromone binding protein/general binding protein）是鳞翅目昆虫OBP家族的一个重要单系群。染色体上定位发现这些基因以基因簇的形式存在于第19染色体的nscaf3052上,基因结构相似,转录方向一致,表明这些基因可能由同源基因复制产生,并具有类似功能;对其潜成虫和成虫阶段多个发育时期的雌、雄虫多种组织中进行表达分析,发现这些基因在不同发育时期的不同组织间差异明显,相对表达量均以触角中为最高,其它非嗅觉组织中也多有表达,性别间差异不大,说明了该基因簇基因除了具有嗅觉相关的功能外,很可能具有其它尚未被发现的功能;而蚕蛾趋性反应结果说明,蚕蛾的嗅觉反应以雄蛾对性引诱的应答为主,而对幼虫期敏感的引诱物或忌避物没有反应,成虫期OBPs的主要功能可能和感受性信息素刺激有关。3对家蚕幼虫期ABP（Antennal binding protein）和ABPX（Antennal binding protein X）基因的蛋白质结构、功能位点、基因表达和功能分析发现,这2个蛋白差异较大,分属不同的OBP群;且这2个基因在嗅觉组织（器官）中均有较高的表达量,但并非仅在嗅觉器官中表达,基本上在所检测的组织中均有表达。摘除实验结果显示,二者可能和幼虫对食物的趋性相关;但5龄期注射dsRNA和口服细菌表达的dsRNA实验表明,RNAi能够显著降低目的基因的表达,但未引起家蚕的嗅觉失灵,而对家蚕幼虫5龄期的发育经过有明显的延缓作用。这些结果表明,这2个基因在幼虫期可能和幼虫的对食物的趋性相关,并具有其他重要的、和发育相关的生理功能。4克隆得到了野桑蚕性信息素感受过程中的重要基因PBP1、PBP2、PBP3、OR1和OR3。序列分析发现,家蚕和野桑蚕基因间的遗传距离很近,基因变异较小,且以转换为主,核苷酸变异未引起蛋白质二级结构的变化,其重要的功能位点也未发生变异,推测其基因的功能未发生变化,故二者能够相互感受、识别。为通过杂交开发、利用野桑蚕资源提供了理论依据;同时,这也是家蚕起源于野桑蚕的分子证据。5普遍认为,GOBP（general OBP）具有结合食物和环境中各种普通的气味分子的能力。对13种昆虫GOBP亚家族分子进化分析结果表明,GOBP1和GOBP2氨基酸和核苷酸的一致性很高,序列差异性很小,其亲缘关系非常近,其中半胱氨酸和色氨酸非常保守,但是它们来自不同的祖先基因,并在物种分化之前已经分化完成。基于氨基酸序列的ω分析表明,Ka/Ks率一般都很低,仅在烟夜蛾和棉铃虫GOBP1的分化进化过程中受到正向选择作用,而在其他分化过程中均未检测出正向选择作用。表明GOBP基因在昆虫间可能具有相似的功能。6家蚕的食性相关分子标记研究表明,家蚕对人工饲料育摄食性相关性状可能主要受不食基因控制;RAPD标记结果具有明显的多态性,SSR标记的多态性较少,其对应的特异引物主要为染色体第10、11、17、19、20、27、28号上的标记,其中以第20号染色体的标记最多,且多为高摄食性亲本的特异性条带,说明家蚕对人工饲料摄食性的基因很可能位于其上;而位于17号染色体的标记扩增出的特异性条带多来自于低摄食性亲本,表明家蚕对人工饲料不食基因可能位于其上。这为进一步确定食性相关性状的分子标记,利用分子标记辅助育种,培育对人工饲料育高摄食性品种奠定了基础,有助于产业进步,也有利于害虫的防治和其他益虫的饲养。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 昆虫的化学感受与嗅觉机制
• 1.1 昆虫的化学感受
• 1.2 昆虫的化学感受器与类型
• 1.3 昆虫化学感受的相关蛋白
• 1.3.1 昆虫的气味结合蛋白
• 1.3.2 昆虫的气味受体
• 1.3.3 昆虫的化学感受蛋白
• 1.3.4 气味降解酶
• 1.3.5 感觉神经元膜蛋白
• 1.4 昆虫的嗅觉机制
• 1.4.1 昆虫嗅觉途径
• 1.4.2 昆虫嗅觉感受模型
• 1.5 昆虫嗅觉机制前景和应用意义
• 2 RNAi 及其在昆虫学研究中的应用
• 2.1 RNAi 的发现与发展
• 2.2 RNAi 的分子机制
• 2.2.1 起始阶段
• 2.2.2 效应阶段
• 2.2.3 扩增阶段
• 2.3 RNAi 的生物学意义
• 2.3.1 RNAi 抵御病毒感染
• 2.3.2 RNAi 抑制转座子运动
• 2.3.3 RNAi 参与异染色质的形成与维持
• 2.3.4 RNAi 参与机体的发育调控及生理代谢
• 2.4 RNAi 的系统性
• 2.5 RNAi 在昆虫中导入方式
• 2.5.1 昆虫RNAi 的导入方式
• 2.5.1.1 注射法
• 2.5.1.2 饲喂法
• 2.5.1.3 组织培养法
• 2.6 RNAi 在家蚕中的应用及前景
• 3 家蚕的遗传标记
• 3.1 家蚕遗传学研究的概况
• 3.1.1 近代的家蚕遗传学研究概况
• 3.1.2 现代的家蚕遗传学研究概况
• 3.1.3 家蚕作为遗传学研究材料的优点
• 3.2 家蚕的遗传标记
• 3.2.1 形态标记
• 3.2.2 生化标记
• 3.2.3 细胞学标记
• 3.2.4 分子标记
• 第二章 主要试剂与常用实验方法
• 1 常用试剂
• 1.1 培养基
• 1.1.1 LB 液体培养基（Luria-Bertani Medium）
• 1.1.2 LB 固体培养基
• 1.2 常用溶液
• 1.2.1 Tris·EDTA（TE）缓冲液（pH8.0）
• 1.2.2 碱变性法质粒抽提缓冲液
• 1.2.3 氨苄青霉素（ampicillin,Amp）
• 1.2.4 RNaseA
• 2（75 mmol/L）'>1.2.5 CaCl₂（75 mmol/L）
• 1.2.6 3 mol/L NaAc（pH 5.2）
• 1.2.7 溴化乙锭（ethidium bromide,EB）
• 1.2.8 X-gal（2%,m/v）
• 1.2.9 IPTG
• 1.2.10 1.2 %琼脂糖（Agarose）
• 1.2.11 DEPC 处理水
• 1.2.12 TAE 电泳缓冲液（50×储存液,pH 约 8.5）
• 2 主要仪器设备
• 3 常用实验方法
• 3.1 碱裂解法少量制备质粒DNA
• 3.2 家蚕组织总RNA 提取
• 3.3 家蚕DNA 提取
• 2 法制备E.coli 感受态细胞'>3.4 CaC1₂ 法制备E.coli 感受态细胞
• 3.5 Reverse Transcription-PCR 反应（RT-PCR）
• 3.6 PCR 扩增反应程序及加样体系
• 3.7 PCR 产物的回收
• 3.8 连接反应
• 3.9 重组DNA 的转化
• 3.10 重组质粒的筛选
• 3.11 限制性内切酶反应
• 3.12 家蚕OBP 基因表达半定量分析
• 第三章 家蚕OBP 家族的生物信息学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 主要数据库及软件
• 1.1.1 数据库及网址
• 1.1.2 所用生物信息学软件
• 2 结果与分析
• 2.1 家蚕OBP 家族核苷酸序列分析
• 2.1.1 家蚕OBP 家族基因染色体定位
• 2.1.2 家蚕OBP 家族基因结构分析
• 2.1.3 家蚕OBP 家族基因电子表达谱分析
• 2.1.4 家蚕OBP 家族基因进化分析与遗传距离
• 2.2 家蚕OBP 家族蛋白序列分析
• 2.2.1 家蚕OBP 蛋白生化特征
• 2.2.2 家蚕OBP 蛋白跨膜区和疏水性预测
• 2.2.3 家蚕OBP 蛋白氨基酸序列分析
• 3 结论与讨论
• 第四章 家蚕潜成虫和成虫期PBP/GOBP 亚家族基因簇基因定位、表达与蚕蛾趋性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 PBP/GOBP 亚家族基因序列获取与染色体定位
• 1.2 家蚕品种与组织选取和RT-PCR
• 1.3 基因表达水平分析
• 1.4 家蚕蛾的趋性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 家蚕PBP/GOBP 亚家族基因簇基因在染色体上的定位与排布分析
• 2.2 家蚕PBP/GOBP 亚家族基因表达谱分析
• 2.2.1 羽化前1 天家蚕PBP/GOBP 亚家族基因的表达分析
• 2.2.2 羽化当日家蚕PBP/GOBP 亚家族基因的表达分析
• 2.2.3 家蚕蛹和成虫不同时期触角中PBP/GOBP 亚家族基因的表达分析
• 2.2.4 家蚕蛾的趋性测定
• 3 结论与讨论
• 3.1 家蚕PBP/GOBP 基因簇
• 3.2 家蚕PBP/GOBP 基因簇基因的表达与功能分析
• 第五章 家蚕ABP 和ABPX 的表达与功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 家蚕ABP 和ABPX 的序列、结构与功能位点分析
• 1.2 不同发育阶段家蚕ABP 和ABPX 基因表达分析
• 1.3 基于RNAi 的家蚕ABP 和ABPX 功能研究
• 1.3.1 注射化学合成的dsRNA 研究家蚕ABP 和ABPX 的功能
• 1.3.2 口服细菌表达的dsRNA 研究家蚕ABP 和ABPX 的功能
• 1.3.3 RNAi 对家蚕对桑叶趋性的影响
• 1.3.4 RNAi 对家蚕发育的影响
• 1.3.5 RNAi 对基因表达的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 家蚕ABP 和ABPX 的序列、结构与功能位点分析
• 2.2 不同发育阶段家蚕ABP 和ABPX 基因表达分析
• 2.2.1 家蚕胚胎期ABP 和ABPX 基因的表达
• 2.2.2 家蚕幼虫不同时期ABP 和ABPX 基因的表达
• 2.2.3 5 龄中期不同组织器官ABP 和ABPX 基因的表达
• 2.3 家蚕ABP 和ABPX 的RNAi
• 2.3.1 dsRNA 的合成与家蚕的处理
• 2.3.2 注射dsRNA 对家蚕的影响
• 2.3.3 口服细菌表达的dsRNA 对家蚕的影
• 3 结论与讨论
• 3.1 家蚕ABP 和ABPX 基因表达与功能分析
• 3.2 家蚕ABP 和ABPX 的RNAi 系统性与效应
• 3.3 口服细菌表达载体产生的dsRNA 用于昆虫RNAi 分析
• 第六章 野桑蚕pbp、or1 和or3 基因的克隆与进化分析
• 1 材料与方法
• 1.1 野桑蚕蛾
• 1.2 试剂
• 1.3 野桑蚕基因的克隆与测序
• 1.4 基因序列分析
• 1.5 遗传距离和进化分析
• 2 结果与分析
• 2.1 野桑蚕和家蚕的PBP 和OR 基因变异分析
• 2.2 野桑蚕和家蚕的PBP 成熟蛋白和OR 蛋白的二级结构分析
• 2.3 野桑蚕和家蚕同源基因遗传距离分析
• 2.4 进化速率
• 2.5 5 种昆虫PBP 蛋白进化分析
• 3 结论与讨论
• 3.1 野桑蚕和家蚕的基因的变异及其与蛋白质功能的关系
• 3.2 野桑蚕和家蚕PBP 亚家族基因的进化比较
• 第七章 昆虫GOBP 的分子进化分析
• 1 材料与方法
• 1.1 GOBP 蛋白及cDNA 序列获取
• 1.2 13 个物种GOBP 的氨基酸同源比对及聚类分析
• 2 结果分析
• 2.1 13 种昆虫GOBP 蛋白的聚类分析及氨基酸同源比对
• 2.1.1 13 种昆虫GOBP 聚类分析
• 2.1.2 13 种昆虫GOBP 蛋白氨基酸和核苷酸序列一致性与差异性分析
• 2.1.3 13 种昆虫GOBP 蛋白序列的遗传距离分析
• 2.1.4 13 种昆虫GOBP 氨基酸残基替代分析
• 2.2 13 种昆虫GOBP 蛋白基于氨基酸序列的ω分析
• 2.3 13 种昆虫GOBP 蛋白氨基酸序列分析
• 3 结论与讨论
• 第八章 家蚕食性相关分子标记研究
• 1 材料与方法
• 1.1 家蚕品系及对人工饲料的摄食性鉴定
• 1.2 家蚕DNA 提取与检测
• 1.3 分子标记PCR
• 1.3.1 引物设计
• 1.3.2 RAPD-PCR 反应体系及条件设置
• 1.3.3 SSR-PCR 反应体系及条件设置
• 2 结果与分析
• 2.1 家蚕高摄食性和低摄食性纯系的摄食性调查
• 2.2 家蚕DNA 检测
• 2.3 分子标记分析
• 2.3.1 RAPD 标记分析
• 2.3.2 SSR 标记分析
• 3 结论与讨论
• 第九章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文与研究成果