论文摘要
目的本研究运用RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术,沉默抑癌基因RUNX3的表达,观察RUNX3基因转录水平沉默对人胃癌细胞系SGC7901生长增殖的影响,并探讨其可能机制。方法根据RNAi的设计原则,设计与合成靶向RUNX3基因启动子发卡样特异性干扰寡核苷酸序列（short hairpin RNAs,shRNAs）;构建特异性真核表达载体pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3,将重组的真核表达载体转染SGC7901细胞系,经G418筛选,RT-PCR、Western blotting及SP免疫细胞化学方法,鉴定与检测RUNX3基因mRNA及蛋白质质表达水平的变化,获得RUNX3基因稳定表达沉默的pSilencer3.1-H1-shRNA/ RUNX3/SGC7901细胞系;扩大培养阳性细胞克隆,通过绘制RUNX3基因表达沉默的SGC7901细胞系生长曲线、检测其克隆形成率、分析细胞周期改变,观察RUNX3基因表达沉默对SGC7901细胞生长增殖的影响,经HE染色,观察细胞形态改变;然后应用不同浓度的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5’-氮杂-2’-脱氧胞苷（5’-Aza-2’-deoxycytidine, 5-Aza-CdR）处理pSilencer3.1-H1-shRNA/ RUNX3/SGC7901细胞系,运用RT-PCR和Western blotting方法,检测RUNX3基因mRNA及蛋白质质表达水平。结果重组质粒DNA经酶切和测序鉴定,结果均证实pSilencer3.1-H1- RUNX3-shRNA真核表达载体构建成功。采用Lipofectamine 2000脂质体将pSilencer3.1-H1-RUNX3-shRNA和pSilencer3.1-H1空载体分别转染SGC7901细胞,G418筛选,阳性细胞克隆,经RT-PCR、Western blotting及SP免疫细胞化学方法,进行鉴定,成功建立RUNX3表达沉默的SGC7901细胞系。绘制细胞生长曲线结果表明: pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901组较转空载体组和未转染组,细胞生长增殖速度加快（P<0.05）,而转空白载体组和未转染组生长速度相近（P>0.05）。软琼脂克隆形成实验结果显示:转pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3基因组细胞集落形成率为（17.4±0.31）%,转空载体组和未转染组的集落形成率分别为（9.9±0.3）%和（9.7±0.6）%,转基因组细胞集落形成率明显高于转空载体组和未转染组,差异具有统计学意义（P<0.01）。进一步采用流式细胞仪,检测RUNX3基因表达沉默对SGC7901细胞周期的影响,实验结果显示:RUNX3基因表达沉默组与转空白载体组和未转染组相比较,RUNX3基因表达沉默组细胞群体中,处于G0/G1期细胞比例降低,而S期细胞比例增高,差异具有显著性意义（P<0.05）,而转空白载体组和未转染组间细胞周期改变差异无显著性意义（P<0.05）。HE染色,光镜观测显示:三组细胞均为中分化粘液腺癌,其中RUNX3基因表达沉默组细胞核分裂增多,可见多个瘤巨细胞。经不同浓度的5-Aza-CdR处理转染pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901细胞,经RT-PCR及Western blotting方法检测,研究结果显示,5-Aza-CdR未能恢复RUNX3基因在pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901细胞中的表达。结论1.构建pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3真核表达载体,成功建立RUNX3基因表达沉默的pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901细胞系。2.RUNX3基因在SGC7901细胞系表达沉默,使SGC7901细胞生长增殖速度加快,软琼脂克隆形成能力增强,细胞群体中G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例增高,病理性核分裂像多见,并可见瘤巨细胞。3.采用shRNA载体沉默RUNX3基因表达后,5-Aza-CdR处理未能重新恢复RUNX3基因的表达。
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