大豆萜类非甲羟戊酸代谢途径关键酶基因的克隆及功能鉴定

论文摘要

大豆是重要的经济作物,但其生育期常受到病虫害的困扰。萜类化合物在生态系统中发挥重要作用,如增强植物抗病能力、帮助植物抵御天敌等。植物萜类物质的合成有两条合成途径,即存在于细胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径和存在于质体中的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径。与MVA途径的研究相比,MEP途径的研究刚刚起步,尽管一些与该代谢途径相关的基因已被克隆,但其代谢调控的研究仍不清楚。本文主要对MEP代谢途径中的限速酶和关键酶基因进行了克隆及功能鉴定。MEP途径关键酶基因的成功克隆,一方面有助于了解萜类化合物生物合成与调控的分子机制,同时也为利用代谢工程方法调节MEP途径中代谢流的分布,提高萜类物质含量提供了基因靶点,具有重要的理论意义和应用价值。主要取得了以下一些研究进展。1、从大豆中克隆了催化MEP途径生物合成的第一个限速酶基因GmDXS1并进行了表达分析。序列分析表明GmDXS1基因编码的蛋白与其它植物DXS蛋白有很高的同源性,具有DXS蛋白固有的特征和保守域:N端有引导DXS定位于质体的转运肽,该转运肽在细菌中是没有的;含有绝对保守的功能位点His;含有硫胺素（TPP）结合域,（起始于保守序列-GDG-,终止于保守序列-LNDN-）和DXS的指纹氨基酸基序DRAG。系统进化分析表明GmDXS1基因属于Ⅰ类植物DXS。表达分析表明GmDXS1基因在光合组织中表达,且其表达受高温诱导。Southern blot分析发现该基因在大豆基因组中只有一个拷贝,推测可能是功能蛋白。将GmDXS1基因与GFP融合转化烟草植株,绿色荧光蛋白检测证明GmDXS1基因定位于叶绿体。对转基因植株的萜类化合物的含量进行测定发现,GmDZS1基因的过量表达显著了提高烟草叶绿素、类胡萝卜素和赤霉素的含量,而降低了脱落酸的含量。2、从大豆中克隆了两个编码DXR蛋白的同源基因,DXR是MEP途径生物合成第二个限速酶。序列分析表明2个GmDXRs基因编码的蛋白其N端都含有引导DXR定位于质体的特有的转移肽序列和保守的脯氨酸富集区（Proline-rich region）。同时也具有DXR活性所必需的典型的多肽位点,即两个DXR活性motif和两个NADPH结合motif。但这两个同源基因之间仅有74%的相似性。系统进化分析发现这两个基因在进化上有很大分离。Southern blot分析发现两个GmDXRs基因在大豆基因组中都有两个拷贝,而以前的研究认为植物DXR基因都以单拷贝形式存在。组织表达分析表明GmDXR1在大豆各个组织中组成型表达,而GmDXR2在各个组织中都不表达,推测可能与胁迫相关。高温诱导分析表明GmDXR2表达受热胁迫诱导,而GmDXR1受热胁迫影响较小。将两个GmDXRs基因与GFP融合分别转化烟草植株,绿色荧光蛋白检测证明两个GmDXRs基因都定位于叶绿体。对转基因植株的萜类化合物的含量进行测定发现,GmDXRs基因的过量表达显著提高了烟草叶绿素、类胡萝卜素和赤霉素的含量,而降低了脱落酸的含量。其中,GmDXR2基因的效应较GmDXR1基因显著。3、从大豆中克隆了一个控制单萜化合物合成的关键酶基因GmTPS,对其进行了表达分析及功能鉴定。序列分析表明GmTPS基因编码的蛋白N端含有推测为质体定位的信号肽区域和萜类保守的功能域DDxxD motif。系统进化分析表明GmTPS基因属于萜类合酶TPS-g亚家族。Southern blot分析表明GmTPS基因在大豆基因组中有1个拷贝。组织表达分析表明GmTPS基因在茎、叶、英皮中表达,在根、花、种子中不表达。表达分析表明GmTPS受高温、低温、机械损伤、SA和昆虫啃食诱导。采用GateWay体系构建了GmTPS基因与GFP融合的过量表达载体并转化烟草植株。抑杀菌实验表明转基因烟草植株能够抑制各种微生物的生长,尤其对真菌有很强的抑制作用。抗虫鉴定结果表明转基因植株较野生型植株对斜纹夜蛾幼虫有显著的驱避和生长抑制作用。同时,我们也对萜类化合物的“抗热性”假说进行了探讨,测定了热胁迫后转基因植株和野生型植株的生理指标和光合指标。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物次生萜类物质及其代谢工程研究进展
• 1 植物次生代谢物质
• 2 萜类化合物的合成及其功能
• 2.1 萜类化合物的种类及分布
• 2.2 萜类化合物的生物合成途径及其调控
• 2.2.1 存在于细胞质中的MVA途径
• 2.2.2 存在于质体中的DXP途径
• 2.3 萜类生物合成途径中的关键酶
• 2.3.1 Ⅰ类酶
• 2.3.2 Ⅱ类酶
• 3 萜类化合物的生理生态功能及经济价值
• 3.1 影响萜类化合物产生的因素
• 3.2 萜类化合物的生理功能
• 3.3 萜类化合物在生态系统中的作用
• 3.3.1 增强植物的抗病菌能力
• 3.3.2 对植食性昆虫的作用
• 3.3.3 化感作用
• 3.4 萜类化合物的经济价值
• 3.4.1 农业上是良好的除草剂和天然杀虫剂
• 3.4.2 工业上是天然香料的重要来源
• 3.4.3 医药领域是药物的有效成分
• 4 萜类化合物的代谢工程研究进展
• 4.1 单萜
• 4.2 倍半萜
• 4.3 双萜
• 4.4 三萜
• 4.5 四萜
• 5 展望
• 本研究的目的和意义
• 第二部分 研究报告
• 第二章 大豆DXS基因（GmDXS1）和DXR基因（GmDXRs）的克隆及表达分析
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 材料处理
• 1.3 菌株和载体
• 1.4 方法与步骤
• 1.4.1 大豆基因组DNA的提取
• 1.4.2 大豆总RNA的提取和纯化
• 1.4.3 cDNA第一链的合成
• 1.4.4 GmDXS1、GmDXR1、GmDXR2基因cDNA的克隆
• 1.4.5 Southern杂交
• 1.4.6 半定量RT-PCR分析
• 1.4.7 转基因植物表达载体的构建
• 1.4.8 农杆菌介导法转化烟草
• 1.4.9 转基因烟草植株的分子检测
• 1.4.10 GmDXS1、GmDXRs基因在烟草中亚细胞定位的激光共聚焦扫描显微镜观察
• 1.4.11 转基因烟草腺毛密度的统计
• 1.4.12 转基因植株光合色素含量的测定
• 1.4.13 转基因烟草激素含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 GmDXS1全长cDNA的克隆及序列分析
• 2.2 GmDXR1、GmDXR2全长cDNA的克隆及序列分析
• 2.3 GmDXS1、GmDXR1和GmDXR2的Southern blot分析
• 2.4 GmDXS1、GmDXR1和GmDXR2的表达分析
• 2.4.1 组织表达分析
• 2.4.2 热胁迫诱导表达分析
• 2.5 GmDXS1、GmDXR1和GmDXR2基因在烟草中的异源表达
• 2.5.1 植物表达载体的构建
• 2.5.2 转基因烟草的获得及分子检测
• 2.5.3 GmDXS1、GmDXR1和GmDXR2基因的亚细胞定位
• 2.5.4 GmDXS1转基因烟草叶片腺毛密度统计
• 2.5.5 转基因植株光合色素及激素含量的测定
• 3 讨论
• 3.1 大豆GmDXS1属于Ⅰ类DXS基因,且行使"看家基因"的功能
• 3.2 大豆中有两个DXR基因
• 3.3 GmDXS1、GmDXR1和GmDXR2基因在烟草中的过量表达导致抑制现象
• 第三章 大豆萜类合酶（GmTPS）基因的克隆、表达分析及功能鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 材料处理
• 1.3 菌株和载体
• 1.4 方法与步骤
• 1.4.1 大豆基因组DNA的提取
• 1.4.2 大豆总RNA的提取和纯化
• 1.4.3 cDNA第一链的合成
• 1.4.5 Southern杂交
• 1.4.6 半定量RT-PCR分析
• 1.4.7 GateWay体系构建植物表达载体
• 1.4.8 农杆菌介导法转化烟草
• 1.4.9 转基因烟草植株的分子检测
• 1.4.10 GmTPS基因在烟草中亚细胞定位的激光共聚焦扫描显微镜观察
• 1.4.11 转基因烟草植株挥发性物质的抑菌作用
• 1.4.12 转基因烟草光合特性的测定
• 1.4.13 转基因烟草的耐热性分析
• 1.4.14 转基因烟草植株对斜纹夜蛾幼虫的影响
• 1.4.15 GmTPS基因在E.coli中的表达
• 2 结果与分析
• 2.1 GmTPS全长cDNA的克隆
• 2.2 序列分析及系统进化分析
• 2.3 Southern Blot分析
• 2.4 GmTPS基因的表达分析
• 2.4.1 组织表达分析
• 2.4.2 GmTPS在不同生物和非生物胁迫下的诱导表达分析
• 2.5 GmTPS基因在烟草中的过量表达
• 2.5.1 用GateWay体系构建植物表达载体
• 2.5.2 转基因植株的获得及分子检测（PCR、Southern、RT-PCR）
• 2.5.3 GmTPS基因的亚细胞定位
• 2.5.4 转基因植株的抑菌作用
• 2.5.5 转基因植株对斜纹夜蛾幼虫的影响
• 2.5.6 转基因植株对热胁迫的响应的探讨
• 2.6 GmTPS基因在E.coli中的表达
• 2.6.1 原核表达载体的构建
• 2.6.2 GmTPS基因在E.coli中的诱导表达
• 3 讨论
• 8W结构域'>3.1 大豆TPS合酶基因缺乏保守的RRx₈W结构域
• 3.2 大豆TPS合酶属于Tps-g亚家族
• 3.3 转GmTPS基因植株对斜纹夜蛾幼虫有显著的驱避和生长抑制作用
• 3.4 对类异戊二烯"抗热性"假说的探讨
• 全文结论
• 本研究创新之处
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士期间发表及待发表的论文
• 致谢