麦冬OjERF基因的克隆与功能研究

论文摘要

麦冬（ophiopogpn japonicus）是我国重要的百合科多年生常绿草本植物,其植株类似草、开花,喜好温暖和湿润气候。在中国分布广泛,经常被用作可观赏的园林植物。它具有抗旱、耐盐、耐荫、抗寒、绿期长等优良特性。同时它具有很好的药用价值,长期作为滋阴类中药广泛应用于临床中。因此利用现代分子生物学技术,挖掘其优质基因并进行功能鉴定,对品种改良将有重要的意义。另一方面AP2/ERF类转录因子已经在许多物种中被克隆,它们在信号的传递、下游应答基因的表达调控和细胞发育过程中发挥重要的作用。它们可以与GCC-box、DRE/CRT等顺式作用元件结合,参与生物和非生物胁迫响应。通过转基因的方法单独导入AP2/ERF类转录因子的研究,已经成为物种改良的研究热点。由于全球水资源紧缺和土壤盐渍化严重,干旱和盐胁迫已经成为限制植株生长和农作物产量的主要限制因素。植株的耐盐和抗旱性涉及到多个复杂代谢途径,研究人员对耐盐、抗旱基因工程的研究还处在初级阶段,其分子作用机制也尚不清楚。因此,克隆与抗旱、耐盐相关的转录因子基因,揭示其参与的信号转导途径网络,并通过转基因技术研究该基因在逆境胁迫中发挥的功能,为植物抗逆新品种的选育提供理论依据。本研究以麦冬为实验材料,从中克隆了ERF类转录因子OjERF基因,并对其生物学特性进行分析,通过转化烟草,对其在植株抗旱和耐盐性方面的影响以及调控机理进行了深入的研究,具体的研究结果如下：1.采用RT-PCR方法从麦冬中分离了ERF类转录因子OjERF基因,该基因开放阅读框长1047bp,编码348个氨基酸。氨基酸序列分析显示：它含有一个AP2/ERF典型结构域,推测它具有核定位信号和转录激活区,N-端保守的氨基酸MCGGAII元件,将它归属于ERF类转录因子第四类,是百合科转录因子的新基因。2. RT-PCR分析结果表明OjERF基因在根茎叶中都表达,不具有组织特异表达性,表达水平为叶>茎>根。OjERF基因在麦冬中的表达受到干旱、高盐、低温、ABA和ET不同程度的诱导,变化规律各不相同,说明麦冬OjERF基因可能在逆境胁迫中有一定的作用,同时也可能通过ABA信号转导途径参与逆境胁迫响应。3.通过PEG介导法将构建好的PEZR（K）-LC-OjERF质粒转化已经制备好的水稻原生质体,亚细胞定位结果显示：OjERF蛋白定位于细胞核中。4. OjERF基因与GAL4DB融合后转化酵母细胞,研究表明：OjERF基因具有转录激活功能,可以激活报告基因表达。5.将OjERF基因全长cDNA序列,克隆至原核表达载体pEASY-E1Expression,构建了重组质粒pEASY-E1-OjERF,经过诱导,表达产物SDA-PAGE电泳检测表明,目的蛋白在大肠杆菌中成功表达。6.构建植物表达载体PBI121-OjERF,通过农杆菌侵染叶盘法转化烟草植株,并对TO代植株进行分子鉴定。对转基因烟草进行了耐盐和抗旱性分析,结果显示,在高盐胁迫下,转基因烟草的叶绿素含量是野生型对照的3倍；经过20d的干旱处理,转基因烟草和对照相比,降低了电解质渗透率和丙二醛含量的积累,提高了脯氨酸含量的积累和SOD、CAT酶活性,说明转基因烟草具有更强的抗旱和耐盐能力。另外,在正常生长条件下,转基因烟草NtERD10B、NtERD10C、NtERF5、NtSOD和NtCAT15种抗逆相关基因的表达水平要明显高于非转基因对照,由此推测,麦冬OjER1基因超表达后能够高效激活下游抗逆相关基因的表达。7.实时荧光定量PCR结果显示：转基因烟草ABA合成相关基因NtSDR的表达量会高于非转基因对照。通过ELASA法测定体内ABA含量同样表明,转基因烟草体内有较高的ABA含量,这可能说明OjERF基因可以与多种顺式作用元件结合,通过激活下游抗逆相关基因和ABA合成基因的表达,使体内ABA含量积累,最终通过ABA依赖的信号转导途径提高植株对干早和高盐胁迫的抵抗力。上述结果表明,过量表达OjERF基因提高了烟草的抗旱耐盐能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 引言
• 1.1 植物对逆境胁迫应答的激素信号转导途径
• 1.1.1 乙烯合成和乙烯信号传导途径
• 1.1.1.1 乙烯在植物体内的作用
• 1.1.1.2 乙稀的合成及调控
• 1.1.1.3 乙炼的信号传导途径
• 1.2 植物对非生物胁迫的响应机制
• 1.3 抗逆相关的转录因子
• 1.3.1 转录因子的概念
• 1.3.2 抗逆相关转录因子的分类
• 1.4 ERF类转录因子的研究进展
• 1.4.1 ERFs转录因子的结构特征
• 1.4.2 ERFs转录因子在生物胁迫中的作用
• 1.4.3 ERFs转录因子在非生物胁迫中的作用
• 1.4.4 ERFs转录因子与其他转录因子或蛋白质的协同作用参与逆境胁迫
• 1.5 本研究的目的意义
• 1.6 本研究的主要内容和技术路线
• 1.6.1 主要研究内容
• 1.6.2 技术路线
• 2 麦冬OjERF基因cDNA序列的获得及生物信息学分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒及菌种
• 2.1.3 酶类和试剂
• 2.1.4 引物合成
• 2.1.5 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 麦冬叶片总RNA的提取及纯度检测
• 2.2.2 cDNA第一条链的合成
• 2.2.3 PCR产物的回收
• 2.2.4 连接和转化
• 2.2.5 阳性克隆的鉴定与测序
• 2.2.6 重组质粒的提取及酶切鉴定
• 2.2.7 麦冬OjERF基因序列的生物信息学分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 麦冬叶片总RNA的提取及纯度检测
• 2.3.2 麦冬OjERF基因全长cDNA的克隆
• 2.3.3 麦冬OjERF基因的生物信息学分析
• 2.4 讨论
• 3. 麦冬PkERF基因的表达特性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 处理条件
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 麦冬OjERF基因在不同胁迫和激素处理条件下的表达模式分析
• 3.2.2 麦冬OjERF基因在根、匍匐茎、叶中的表达模式分析
• 3.3 讨论
• 4 麦冬OjERF基因的原核表达、亚细胞定位、转录自激活功能分析
• 4.1 麦冬OjERF基因的原核表达
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 麦冬OjERF基因的亚细胞定位
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 麦冬OjERF基因的转录自激活分析
• 4.3.1 材料
• 4.3.2 酵母单杂交实验方法
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 麦冬OjERF基因的原核表达
• 4.4.2 麦冬OjERF基因的亚细胞定位
• 4.4.3 麦冬OjERF基因的转录自激活分析
• 4.5 讨论
• 5 转基因烟草的鉴定
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 质粒及菌种
• 5.1.3 酶类和试剂
• 5.1.4 引物合成和测序
• 5.1.5 培养基
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 植物表达载体的构建
• 2法的制备农杆菌感受态'>5.2.2 CaCl₂法的制备农杆菌感受态
• 5.2.3 质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞
• 5.2.4 烟草的叶盘侵染法
• 5.2.5 转基因植株的检测
• 5.2.6 PCR检测
• 5.2.7 转基因植株的RT-PCR检测
• 5.2.8 转基因阳性植株的大量扩繁
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 植物表达载体的构建及检测
• 5.3.2 农杆菌转化及阳性鉴定
• 5.3.3 转基因烟草植株的获得
• 5.3.4 转基因植株和野生型植株的形态比较
• 5.3.5 转基因植株的分子检测
• 5.3.6 转基因阳性植株的大量扩繁
• 5.4 讨论
• 6 麦冬OjERF基因可以提高烟草的耐盐与抗旱性
• 6.1 麦冬OjERF基因可以提高烟草的耐盐性
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验方法
• 6.1.3 数据分析
• 6.2 麦冬OjERF基因可以提高烟草的抗早性
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 实验方法
• 6.3 相关基因的表达情况分析
• 6.3.1 实验材料
• 6.3.2 试剂
• 6.3.3 实验方法
• 6.4 ABA合成相关NtSDR基因表达分析
• 6.4.1 利用Primer Premier 5.0软件设计荧光定量PCR所需引物
• 6.4.2 PCR产物的定量分析
• 6.5 ABA含量的测定
• 6.5.1 实验材料
• 6.5.2 实验试剂和耗材
• 6.5.3 实验方法
• 6.6 结果与分析
• 6.6.1 麦冬OjERF基因可以提高烟草的耐盐性
• 6.6.2 麦冬OjERF基因可以提高烟草的抗旱性
• 6.6.3 相关基因的表达情况分析
• 6.6.4 ABA合成基因NtSDR表达水平分析
• 6.6.5 ABA含量测定
• 6.7 讨论
• 7 结论
• 创新点
• 研究展望
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 获得成果目录
• 致谢