小苍兰ACC合成酶基因FhACS1的克隆及其表达特征

论文摘要

以小苍兰为材料,利用Genome-Walking技术克隆了ACC合成酶基因FhACS1 （GenBank登录号为HQ833204）。采用Real-time PCR方法系统地分析了FhACS1基因在不同发育等级小花和不同花朵器官中的表达特征,以及在不同化学物质诱导和干旱、低温环境下的表达模式。主要结果如下：1.首次从小苍兰中克隆到（?）FhACS1基因的全长和CDS序列。FhACS1基因全长2576 bp,5’UTR为433 bp,3’UTR为373 bp；含3个内含子、4个外显子；启动子区含有CAAT-box, TATA-box等特征元件,以及多个响应激素和逆境胁迫的顺式作用元件。Southern杂交结果表明FhACS1基因在基因组中呈低拷贝分布。FhACS1基因CDS为1371 bp,编码含457个αα残基、分子量为51.2 kDa、pI为8.03的蛋白；具备ACS家族的7个保守结构域,转氨酶类结构特征和丝氨酸活性位点；与小果芭蕉同源性最高（85%）；与孟宗竹、水稻、小果芭蕉亲缘关系较近。2.分析了FhACS1基因在花朵中的时空表达特点。不同花朵器官中,FhACS1基因在雄蕊中的表达量最高,在雌蕊中的最低,在花瓣中的居中。前者分别为后两者的5.7倍和2.6倍；不同发育等级小花中,FhACS1基因在完全开放小花中的表达量最高,在花被片刚显色花蕾中最低,前者为后者的32.6倍；花序上不同位置小花中,FhACS1基因在第6朵小花中的表达量显著高于第3朵；清水瓶插期间,（?）FhACS1基因在第3朵小花整朵花、花瓣、雄蕊、雌蕊中的表达模式均为先上升后下降,在整朵花和花瓣中的表达高峰出现在第6天,在雄蕊、雌蕊中的表达高峰分别出现在第4、7天；FhACS1基因在第6朵小花整朵花和花瓣中的表达模式均为持续上升,在雄蕊和雌蕊中的表达模式为先上升后下降,表达高峰分别出现在第3、6天。3.分析了FhACS1基因的诱导表达模式。不同诱导下,第6朵小花FhACS1基因的表达模式与第3朵有显著差异。高、低浓度乙烯利、IAA诱导能加快花序上不同位置小花的发育进程、提早启动小花的衰老并加速衰老进程,诱导FhACS1基因提早响应2～6天、表达量提高2-6倍。其中高浓度乙烯利促进衰老的效果较低浓度乙烯利显著；6～BA、蔗糖、STS诱导能推迟花序上不同位置小花衰老的启动,抑制FhACSl基因表达量的增加,降低表达水平。不同的是,6-BA抑制了小花的发育进程,STS对其无影响,而蔗糖能有效地加速小花的发育进程。4.分析了FhACS1基因在干旱和低温环境中的表达特征。干旱环境中,FhACS1基因的表达量经过缓慢地上升后突然增加,接着逐步下降,到瓶插后期再次剧增；低温环境中,（?）FhACS1基因的表达受到明显地抑制,表达量增加缓慢。第2、3、4点的结果表明,诱导信号能通过影响花朵中FhACS1基因的表达来调控小苍兰花朵的发育和衰老。因此,FhACS1基因的表达能直接影响花朵的衰老进程,可以通过抑制小苍兰FhACS1基因的表达来延缓其花朵的衰老。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 1 引言
• 1.1 乙烯与切花衰老的研究进展
• 1.1.1 乙烯概述
• 1.1.2 乙烯的作用途径及其与切花衰老关系
• 1.1.3 外源化学物质与乙烯的交互作用和对切花衰老的影响
• 1.1.4 环境条件对切花乙烯生成以及衰老的影响
• 1.2 ACC合成酶基因（ACS）的研究进展
• 1.2.1 乙烯的生物合成途径
• 1.2.2 ACC合成酶（ACS）（?）特性
• 1.2.3 ACC合成酶基因（ACS）的克隆及序列特性
• 1.2.4 ACS基因表达的诱导因子
• 1.2.5 ACS基因的表达特征
• 1.2.6 ACS基因在植物基因工程中的应用
• 1.3 研究的目的和意义
• 1.3.1 目的和意义
• 1.3.2 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种与载体
• 2.1.3 试剂及试剂盒
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 PCR引物序列
• 2.2 小苍兰ACC合成酶基因FhACS1的克隆
• 2.2.1 小苍兰DNA、RNA提取以及FhACS1基因中间片段的分离
• 2.2.2 FhACSl基因3'和5'末端序列克隆
• 2.2.3 FhACS1基因DNA全长的克隆
• 2.2.4 FhACS1基因CDS序列的克隆
• 2.2.5 FhACS1基因DNA和蛋白序列的生物信息分析
• 2.3 FhACS1基因在小苍兰基因组中的拷贝数分析
• 2.3.1 CTAB法大量粗提小苍兰花瓣总DNA
• 2.3.2 DNA的纯化
• 2.3.3 基因组总DNA的酶切消化和电泳分离
• 2.3.4 转膜印迹
• 2.3.5 探针标记
• 2.3.6 预杂交和杂交
• 2.3.7 洗膜
• 2.4 小苍兰FhACS1基因的表达特征研究
• 2.4.1 材料处理与采样
• 2.4.2 样品总RNA的提取和eDNA的获得
• 2.4.3 FhACS1基因及内参基因引物设计
• 2.4.4 FhACS1基因及内参基因标准曲线的制作
• 2.4.5 样品中FhACS1基因的定量分析（Real-time PCR）
• 2.4.6 Real-time PCR数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 小苍兰ACC合成酶基因FhACSl的分离
• 3.1.1 FhACS1基因中间片断序列
• 3.1.2 FhACS1基因3'端序列
• 3.1.3 FhACS1基因5'端序列
• 3.1.4 FhACS1基因DNA全长
• 3.1.5 FhACS1基因的CDS序列
• 3.2 小苍兰FhACS1基因的生物信息分析
• 3.2.1 FhACS1基因的序列分析
• 3.2.2 FhACS1基因推导蛋白结构分析
• 3.2.3 分子进化树分析
• 3.3 FhACS1基因在小苍兰基因组中的拷贝数
• 3.4 小苍兰FhACS1基因的表达特征分析
• 3.4.1 目的基因及内参基因的标准曲线
• 3.4.2 FhACS1基因在小苍兰不同发育等级花朵中的表达特征
• 3.4.3 FhACS1基因在整朵花、花瓣、雄蕊、雌蕊中的表达特征
• 3.4.4 瓶插期间FhACS1基因在不同花朵器官中的表达模式
• 3.4.5 FhACS1基因在乙烯利诱导下的表达模式
• 3.4.6 FhACS1基因在IAA诱导下的表达模式
• 3.4.7 FhACS1基因在6-BA诱导下的表达模式
• 3.4.8 FhACS1基因在蔗糖诱导下的表达模式
• 3.4.9 FhACS1基因在STS诱导下的表达模式
• 3.4.10 FhACS1基因在干旱和低温环境中的表达特征
• 4 讨论和总结
• 4.1 FhACS1基因的特征分析
• 4.2 FhACS1基因在花朵中的时空表达特征
• 4.2.1 在不同发育等级花朵和不同花朵器官中的表达特征
• 4.2.2 瓶插期间在不同花朵器官中的表达特征
• 4.3 FhACS1基因的诱导表达模式
• 4.3.1 乙烯利对花朵FhACS1基因表达的影响
• 4.3.2 IAA对花朵FhACS1基因表达的影响
• 4.3.3 6-BA对花朵FhACS1基因表达的影响
• 4.3.4 蔗糖对花朵FhACS1基因表达的影响
• 4.3.5 STS对花朵FhACS1基因表达的影响
• 4.4 干旱和低温对FhACS1基因表达的影响
• 4.5 总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介