新型全细胞催化剂在麻疯树生物柴油中的应用

论文摘要

生物催化剂是生物柴油转酯反应研究中重要的研究对象，目前新酶种的发现和全细胞催化剂的开发是这个领域中的研究热点。麻疯树（Jatropha curcas）是重要的植物油脂资源，对生物柴油的开发具有重要价值，为此本文研究了麻疯树油脂代谢的重要代谢酶——脂肪酶，通过粉状毕赤酵母表达系统初步开发了该酶的全细胞催化剂，并且研究了该催化剂对麻疯树油脂的催化效率，为麻疯树资源的深层次开发奠定了基础。 本文通过基于生物信息学的基因克隆方法首次克隆了麻疯树脂肪酶（JcLIP3），通过RACE实验获得了该基因全长序列，基因长1582bp，其最长读框编码356个氨基酸蛋白质，在大肠杆菌中表达实验表明，麻疯树脂酶具有活性0.8U／mL，同时运用生物信息学手段对JcLIP3基因核酸以及蛋白质序列做出了分析，预测了蛋白质的活性中心，并且发现蛋白质在“lid”结构上与毛霉脂酶存在较大差异。 本文首次构建了粉状毕赤酵母的表达系统，确定了转化系统的整合载体结构，感受态制备方案以及电击转化的参数，最终证明该表达系统在20天的连续培养中不会丢失，并且将麻疯树脂酶基因在该酵母中成功地表达，通过RT-PCR、蛋白质电泳以及酶活测定等实验证明了麻疯树脂酶能够在该酵母正确表达出具有活性的蛋白质。 在生物柴油制备研究中，我们比较了本文全细胞催化剂和不同公司的固定化脂肪酶对麻疯树油脂和大豆油脂的作用效果，结果表明麻疯树油脂中油酸甲酯和亚油酸甲酯含量相当且较多，而棕榈酸甲酯和亚麻酸甲酯略少。麻

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 麻疯树脂酶全长基因克隆及其在大肠杆菌中的表达
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种和载体
• 1.1.2 酶制剂
• 1.1.3 试剂盒
• 1.1.4 常用培养基和缓冲液
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 麻疯树的组培
• 1.2.2 麻疯树总RNA分离
• 1.2.3 麻疯树脂酶全长基因EST引物设计
• 1.2.4 麻疯树脂酶全长基因EST扩增
• 1.2.5 麻疯树脂酶全长基因cDNA3’RACE扩增3’端未知序列
• 1.2.6 麻疯树脂酶全长基因cDNA 5’RACE引物设计
• 1.2.7 麻疯树脂酶全长基因cDNA 5’RACE扩增5’端未知序列
• 1.2.8 麻疯树脂酶全长基因全长cDNA序列拼接
• 1.2.9 麻疯树脂酶全长基因ORF的验证
• 1.2.10 麻疯树脂酶全长基因内部EcoRI酶切位点的消除
• 1.2.11 麻疯树脂酶重组表达质粒的构建
• 1.2.12 麻疯树脂酶在大肠杆菌中的诱导表达
• 1.2.13 表达产物的活性测定
• 2.结果与分析
• 2.1 麻疯树脂酶JcLIP基因EST验证
• 2.2 麻疯树脂酶JcLIP基因cDNA 3’RACE
• 2.3 麻疯树脂酶JcLIP基因cDNA 5’RACE
• 2.4 麻疯树脂酶JcLIP基因全长cDNA拼接以及编码框验证
• 2.5 麻疯树JcLIP基因在大肠杆菌中表达
• 2.6 麻疯树JcLIP基因在大肠杆菌中表达产物酶活的测定
• 3.讨论
• 3.1 通过EST进行基因克隆的策略
• 3.2 应用快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE）方法获得麻疯树JcLIP全长基因
• 3.3 麻疯树JcLIP全长基因在大肠杆菌中的表达策略
• 4.小结
• 第二章 麻疯树脂酶基因生物信息学分析预测
• 1.分析方法
• 1.1 核苷酸序列分析
• 1.1.1 核酸GC含量分布
• 1.1.2 起始ATG的预测
• 1.1.3 加A信号位点预测
• 1.1.4 相似性搜索
• 1.1.5 多重序列比对
• 1.2 蛋白质序列分析
• 1.2.1 基于一级结构的蛋白质性质
• 1.2.2 蛋白质序列亲疏水性分析
• 1.2.3 数据库搜索
• 1.2.4 功能结构域的确定
• 1.2.5 二级结构预测
• 1.2.6 三级结构预测
• 1.2.7 蛋白质家族分析
• 1.2.8 系统发育分析
• 2.结果与分析
• 2.1 核苷酸序列分析
• 2.1.1 核酸GC含量分布
• 2.1.2 起始ATG的预测
• 2.1.3 加A信号位点预测
• 2.1.4 相似性搜索
• 2.1.5 多重序列比对
• 2.2 蛋白质序列分析以及结构预测
• 2.2.1 基于一级结构的蛋白质性质
• 2.2.2 蛋白质序列亲疏水性分析
• 2.2.3 数据库搜索
• 2.2.4 功能结构域的确定
• 2.2.5 二级结构预测
• 2.2.6 三级结构预测
• 2.2.7 蛋白质家族分析
• 2.2.8 系统发育分析
• 3.讨论
• 3.1 对麻疯树脂肪酶生物信息学分析策略
• 3.2 麻疯树脂酶的结构及功能预测
• 4.小结
• 第三章 新型酵母表达系统——粉状毕赤酵母表达系统构建
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 载体
• 1.1.3 工具酶
• 1.1.4 试剂盒
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 粉状毕赤酵母与巴斯德毕赤酵母生长特性的研究
• 1.2.2 粉状毕赤酵母抗性研究
• 1.2.3 粉状毕赤酵母整合型载体的构建
• 1.2.3.1 粉状毕赤酵母整合型载体中抗性基因的合成
• 1.2.3.2 粉状毕赤酵母整合型中间载体构建
• 1.2.3.3 粉状毕赤酵母整合型载体的整合位点获得
• 1.2.3.4 粉状毕赤酵母整合型载体的获得
• 1.2.4 粉状毕赤酵母高效感受态细胞制备
• 1.2.5 粉状毕赤酵母高效电击转化
• 1.2.6 粉状毕赤酵母阳性克隆验证
• 1.2.7 粉状毕赤酵母阳性克隆遗传稳定性验证
• 2.结果与分析
• 2.1 粉状毕赤酵母与巴斯德毕赤酵母生长特性的研究
• 2.2 粉状毕赤酵母抗性研究
• 2.3 粉状毕赤酵母ura3基因的克隆
• 2.4 粉状毕赤酵母整合型载体的构建
• 2.5 粉状毕赤酵母转化系统的构建
• 2.5.1 不同载体对酵母转化的影响
• 2.5.2 酵母感受态细胞制备及其优化
• 2.5.3 粉状毕赤酵母电转化条件的优化
• 2.6 粉状毕赤酵母阳性克隆的检测和遗传稳定性研究
• 3.讨论
• 3.1 新型表达系统的开发
• 3.2 酵母感受态制备策略
• 4.小结
• 第四章 麻疯树脂酶在粉状毕赤酵母中表达的初步研究
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 载体
• 1.1.3 工具酶
• 1.1.4 试剂盒
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 麻疯树脂酶基因全长ORF的改造
• 1.2.2 麻疯树脂酶表达载体的构建
• 1.2.3 麻疯树脂酶表达载体pKU-JcLIP的转化
• 1.2.4 粉状毕赤酵母阳性克隆验证
• 1.2.5 麻疯树脂肪酶在粉状毕赤酵母中的表达研究
• 1.2.5.1 麻疯树脂肪酶在粉状毕赤酵母中的表达RNA水平研究
• 1.2.5.2 麻疯树脂肪酶在粉状毕赤酵母中的表达蛋白质水平研究
• 1.2.5.3 麻疯树脂肪酶在粉状毕赤酵母中的酶活研究
• 2.结果与分析
• 2.1 麻疯树脂酶JcLIP基因的改造及表达载体的构建
• 2.2 麻疯树脂酶JcLIP基因表达的转录水平的研究
• 2.3 麻疯树脂酶JcLIP基因表达的蛋白质水平的研究
• 2.4 麻疯树脂酶JcLIP基因表达的酶活研究
• 3.讨论
• 4.小结
• 第五章 Lipase催化产生生物柴油的转脂反应
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 反应用油
• 1.1.2 Lipase酶制剂
• 1.1.3 气相色谱标准品
• 1.1.4 其他试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 粉状毕赤酵母全细胞催化剂的制备
• 1.2.2 催化反应
• 1.2.3 气相色谱分析
• 2、实验结果
• 2.1 反应结束后样品的变化
• 2.2 气相色谱分析结果
• 2.3 各样品反应结束后的酯转化率
• 3、讨论
• 4、小结
• 参考文献
• 综述 可再生资源在生物柴油研究中的应用
• 一、生物柴油的研究进展
• 1.生物柴油的特性
• 1.1 生物柴油的理化性质
• 1.2 尾气排放物
• 1.3 生产生物柴油的能耗
• 1.4 排放物对人体的影响
• 2.生物柴油的发展史
• 3.生物柴油的合成方法
• 3.1 直接混合法
• 3.2 微乳液法
• 3.3 高温热裂解法
• 3.4 酯交换法
• 4.生物柴油在各国家的应用
• 4.1 美国
• 4.2 欧洲国家
• 4.3 其他国家
• 二、可再生资源的在生物柴油中的应用
• 1.能源植物
• 1.1 大豆
• 1.2 油菜
• 1.3 麻疯树
• 1.4 棕榈树
• 1.5 油茶
• 1.6 橡树
• 1.7 油桐
• 1.8 黄连木
• 1.9 光皮树
• 2.藻类资源
• 3.微生物资源
• 三、生物技术在生物柴油领域中的应用
• 1.生物技术对脂肪酶在生物柴油中应用的影响
• 1.1 固定化酶技术在生物柴油生产中的应用
• 1.2 全细胞生物催化剂在生物柴油生产中的应用
• 1.3 新酶的发现
• 2.基因工程技术对油料资源产生的影响
• 2.1 基因工程技术改造油料作物的脂肪酸代谢
• 2.2 基因工程技术在新型生物柴油细胞反应器中的应用
• 四、展望
• 参考文献
• 致谢
• 在攻读学位期间发表的论文