中国林蛙皮肤胶原蛋白的提取纯化及性质研究

论文摘要

胶原（Collagen）是由三条肽链组成的螺旋形、纤维状蛋白质,富含于动物的骨、结缔组织和皮肤中,组成胶原分子的肽链被称为胶原蛋白。中国林蛙是重要的特种经济动物,提取林蛙卵油后留下大量的蛙皮废弃物中富含胶原蛋白。研究表明,胶原蛋白具有合成高分子不可比拟的生物相容性、生物降解性和低抗原性,因此应用领域广泛。主要用于生物医学材料、食品、营养保健品、化妆品等。本文为了充分利用中国林蛙资源,对蛙皮胶原蛋白进行了提取纯化和性质研究。通过测定,得到林蛙皮肤中胶原蛋白含量不少于26%,是一种很好的胶原蛋白提取原料。为提高测定数据的准确性,对消解测定方法进行了修正,建立了适用于中国林蛙皮肤胶原蛋白含量的计算公式,添加了校正因子λ=1.23。并最终得到适合于中国林蛙皮胶原蛋白含量测定的计算公式:M0=（C×稀释倍数×总体积/换算系数）×λ。本试验采用酸酶结合提取,破坏一部分肽键,使得胶原变成可以被醋酸溶解的可溶性胶原蛋白,从而达到提取的目的。对酸酶结合提取条件进行了优化,优化后的提取条件为:m（胃蛋白酶）:m（原料）=1:50,提取温度37℃,保温时间72h,提取缓冲液50ml 0.5mol/L冰醋酸,提取两次,最终的提取率可达到81.66%,正交试验方差分析表明,酶解温度是影响提取率的重要因素,对结果的影响最为显著。对提取得到的胶原蛋白溶液进行纯化。经过超滤浓缩、盐析沉淀、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等纯化步骤后,胶原蛋白溶液浓度达到34.5g/L,纯化倍数为2.326倍,纯度达到96.1%,胶原蛋白总质量1.04g,回收率为39.8%。真空冷冻干燥得到胶原蛋白产品,外观呈松散的絮状,白色略带黄,密度极低,约为0.002g/cm3,极易吸水,吸水后有粘滞感,易粘手,聚成片状。经测定中国林蛙皮肤胶原蛋白的含水量为16.44%。等电点为5.8。在273.5nm处有一个较明显的紫外吸收峰。经SDS-PAGE电泳测定,得到两条较明显的条带,分子量分别为107KD和89KD左右,说明本试验得到了胶原分子解链后的两个α组分蛋白。本文首次以中国林蛙皮肤为原料进行胶原蛋白的提纯和性质研究,为深度开发林蛙资源、节约成本做出了有意义的探索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.1.1 胶原的定义及存在
• 1.1.2 胶原与明胶以及胶原蛋白的区别
• 1.1.3 人体内胶原蛋白的含量及种类
• 1.2 胶原及胶原蛋白的研究进展
• 1.2.1 胶原及胶原蛋白的制备方法
• 1.2.2 胶原蛋白产品商业化
• 1.2.3 胶原及胶原蛋白的检测和性质分析
• 1.3 胶原蛋白的应用
• 1.3.1 胶原蛋白在美容化妆品中的应用
• 1.3.2 胶原蛋白在保健品食品领域的应用
• 1.3.3 胶原及胶原蛋白在生物医学领域的应用
• 1.3.4 胶原用于研究用途
• 1.3.5 胶原蛋白的其它用途
• 1.4 利用中国林蛙皮肤提取胶原蛋白
• 1.5 本论文的研究方向与基本原理
• 2 含量测定及测定方法的改进
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 药品与试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 蛙皮原料胶原蛋白含量的测定
• 2.2.2 消解方法加标回收率的测定
• 2.2.3 胶原蛋白含量测定方法的改进
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 蛙皮原料胶原蛋白含量的测定
• 2.3.2 消解方法的加标回收率
• 2.3.3 胶原蛋白含量测定方法的改进
• 2.4 本章小结
• 3 中国林蛙皮肤胶原蛋白提取条件的优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 药品与试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 提取缓冲液的确定
• 3.2.2 酸酶对比提取试验
• 3.2.3 蛋白酶种类对胶原蛋白提取率的影响
• 3.2.4 酶提取的最佳工艺条件试验
• 3.2.5 正交实验确定酶法提取胶原蛋白最佳条件
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 提取缓冲液的确定
• 3.3.2 酸酶对比提取试验
• 3.3.3 提取胶原蛋白用酶种类的确定
• 3.3.4 酶提取的最佳工艺条件试验
• 3.3.5 酶法提取胶原蛋白最佳条件正交实验结果
• 3.4 本章小结
• 4 胶原蛋白的纯化与性质分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 药品与试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 纯化
• 4.2.2 成品的制备与部分性质测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 纯化结果与分析
• 4.3.2 成品的制备与部分性质测定
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢