维生素D衍生物治疗白癜风的临床观察及对黑素细胞生物学作用研究

论文摘要

第一部分1α，25-二羟维生素D3对黑素细胞增殖及黑素合成影响的研究目的：探讨1α，25-二羟维生素D3对黑素细胞增殖及黑素合成的影响。方法：用环切法取正常人包皮，于体外培养黑素细胞，选择对数生长期的细胞进行测定。黑素细胞培养液中加入不同浓度的1α，25-二羟维生素D3，继续培养48小时后，用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）在酶标仪上测定A值，观察1α，25-二羟维生素D3对黑素细胞增殖的影响；采用酶学方法测定黑素细胞酪氨酸酶活性，用NaOH法处理后测定黑素细胞黑素的含量。结果：10-9～10-5mol／L浓度范围的1α，25-二羟维生素D3对体外培养的黑素细胞的增殖具有促进作用，其中以10-7mol／L 1α，25-二羟维生素D3对黑素细胞的促增殖作用最为明显，但与空白对照组比较无统计意义（P＞0.05）。10-9、10-8mol／L浓度的1α，25-二羟维生素D3明显增强黑素细胞的酪氨酸酶活性，同时促进黑素细胞的黑素含量，与空白对照组比较，酪氨酸酶活性可分别升高137％，123％（P＜0.05）。黑素含量增加分别为40.63％，18.75％（P＜0.05）。1α，25-二羟维生素D3对体外培养的黑素细胞的增殖和色素合成的效应与药物浓度无相关性（P＞0.05）。结论：1α，25-二羟维生素D3能促进黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成，对黑素细胞生长无抑制作用。第二部分维生素D3衍生物对黑素细胞酪氨酸酶、小眼畸形转录因子的蛋白和基因的调节作用目的：1α，25-二羟维生素D3可促进黑素细胞的黑素合成，因酪氨酸酶和小眼畸形转录因子（MITF）与黑素细胞的分化关系密切，为探讨1α，25-二羟维生素D3作用于黑素细胞分化的分子机制，设计本实验以观察1α，25-二羟维生素D3对黑素细胞酪氨酸酶及转录因子—MITF的影响。方法：于体外黑素细胞培养液中，分别加入10-9、10-7、10-5mol／l浓度的1α，25-二羟维生素D3，设不加药组为对照，培养24小时，用Western blot及RT-PCR的方法检测黑素细胞的酪氨酸酶及转录因子—MITF的蛋白及mRNA的表达。结果：与空白组比较，10-9、10-7和10-5mol／l浓度的1α，25-二羟维生素D3使黑素细胞MITF蛋白的表达均增加，分别为157.08％、138.2％，97.9％，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。其中10-9mol／l浓度的1α，25-二羟维生素D3使MITF蛋白表达增高最明显。10-9、10-7mol／l浓度对黑素细胞酪氨酸酶蛋白的表达也较空白对照组增高，分别为270.4％，92.86％（P＜0.05）。其中10-9mol／l浓度的1α，25-二羟维生素D3使酪氨酸酶蛋白表达增高最明显。但10-9、10-7和10-5mol／l浓度的1α，25-二羟维生素D3使黑素细胞酪氨酸酶mRN A的表达均下降（P＜0.05）。结论：1α，25-二羟维生素D3可通过促进黑素细胞MITF和酪氨酸酶的蛋白表达，进而增加黑素细胞的酪氨酸酶和色素合成的量。第三部分维生素D3衍生物对黑素细胞内钙离子水平的影响目的：维生素D3衍生物作用于黑素细胞的机制复杂，作为调节钙离子平衡的主要因子，已有研究发现它可增高角质形成细胞内钙离子浓度，但是否影响黑素细胞的钙离子平衡目前不清楚，本实验利用荧光染色观察1α，25-二羟维生素D3对黑素细胞内钙离子水平的影响。方法：于体外培养黑素细胞，利用特异荧光染料Fluo-4 AM，在加入不同浓度的1α，25-二羟维生素D3下，通过奥林巴斯Fluoview 5.0激光共聚焦显微镜分别实时检测黑素细胞内钙离子浓度的变化，每隔5秒扫描一张。数据经Fluoview 5.0的软件系统对图形及时间进行实时测量而获得，数据以重复测量的方差分析检验进行显著性分析。结果：在10-5、10-7、10-9mol／L1α，25-二羟维生素D3浓度下，黑素细胞内钙离子升高，15s后黑素细胞[Ca2+]i增至高峰，分别为（1.07±0.07）、（1.11±0.04）、（1.02±0.03），与加药前相比分别增加6.6％，11.1％和4.1％，（P＜0.05）。结论：10-5、10-7、10-9mol／L浓度下1α，25-二羟维生素D3能增加黑素细胞内钙离子水平。结果提示黑素细胞内钙离子水平的增高可能参与了1α，25-二羟维生素D3调节黑素细胞增殖、分化的通道。第四部分他卡西醇治疗白癜风的自身对照观察目的：观察外用维生素D3衍生物治疗白癜风的疗效与安全性。方法：采用自身对照的方法，对34名病情稳定的白癜风患者进行观察。取白癜风患者自身面积相近的对称或相邻皮损为靶皮损，皮损处无自发性色素再生。随机选择患者靶皮损分别外用他卡西醇（2μg／g）或安慰剂，每日两次，一月观察一次疗效，记录患者皮损处色素再生面积与治疗前靶皮损面积的百分比，并按全国中西医结合皮肤性病学会色素病学组制定的白癜风疗效标准记录疗效。结果用SPSS统计软件分析数据。结果：根据入选／排除标准，4名患者观察时间不足2月，仅作安全性评价。最终纳入分析30例患者，男16例，女14例，＜18岁（儿童期发病）13例，≥18岁（成人发病型）17例，靶皮损位于面颈部8例，躯干部16例，四肢6例。根据皮损分型，30例患者中寻常型29例，其中局限性3例，肢端性2例，散发性24例；节段型1例。治疗3月后，治疗组总有效率为73.3％，对照组为36.7％，经确切四格表卡方检验，X2=4.9，（P＜0.05）。治疗一月后最初色素再生率为治疗侧23.3％，对照侧6.7％，经卡方检验，X2=3.2，两者无差异（P＞0.05）。2月后治疗侧为53.3％，对照侧为26.7％，两侧的X2=6.125，（P＜0.05）。3月后治疗侧为76.7％，对照侧为50％，两侧的X2=4.08，（P＜0.05）。治疗侧最初色素再生时间早于对照侧。用Logistic多因素回归分析显示治疗侧的治疗效果与患者的性别、年龄、病程、皮损面积、临床分型、靶皮损位置等因素均无相关性。他卡西醇外用未出现不良反应。结论：他卡西醇外用治疗白癜风有效，而且安全。第五部分他卡西醇联合单频准分子光治疗白癜风的对照研究目的评价和对比他卡西醇联合单频准分子光（MEL）308-nm和单用单频准分子光治疗白癜风的疗效和安全性。方法用自身对照的方法，对38例白癜风患者进行观察，取白癜风患者自身面积相近的对称或相邻的皮损为靶皮损，随即选择患者靶皮损分别外用他卡西醇（2μg／g）和安慰剂，每日两次，两侧皮损每周照射一次MEL308-nm，每次照光前2小时外用他卡西醇和安慰剂，两侧皮损照射剂量相同。1月观察一次，拍照并记录患者皮损处色素再生面积与治疗前皮损面积的百分比，并按全国中西医结合皮肤性病学会色素病学组制定的白癜风疗效标准记录疗效。计算最初色素再生和显效时的照光次数和光的累积量。结果：根据入选／排除标准，3名患者观察时间不足3月，仅作安全性评价。最终纳入分析35例患者，其中男19例，女16例，35例患者中寻常型29例，其中局限性3例，肢端性2例，散发性24例；节段型6例。靶皮损位于面颈部16例，躯干部15例，四肢4例。治疗3月后，对35例患者进行评价，联合治疗侧最初色素再生时的照光次数和光的累积量分别为4.89±3.16次和4.27±3.59J／cm2，单照光治疗侧分别为5.69±3.29次和5.36±4.12J／cm2（P＜0.05），显效的患者联合治疗侧为7.79±4.70次和7.72±5.64J／cm2，单照光治疗侧为8.4±3.92次和8.18±4.86J／cm2（P＞0.05）。联合治疗侧的有效率为45.7％，总有效率71.43％，单照光治疗侧分别为25.7％和54.3％（P＜0.05）。结论：他卡西醇外用联合单频准分子光治疗白癜风有效而且安全，可增强MEL308-nm的疗效，提早色素再生的时间和减少照光的能量。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 维生素D3衍生物对黑素细胞增殖和黑素合成代谢的研究
• 前言
• 3衍生物对黑素细胞增殖的影响'>实验一 维生素D₃衍生物对黑素细胞增殖的影响
• 材料与方法
• 实验二 对酪氨酸酶活性的影响
• 材料与方法
• 实验三 对黑素细胞黑素合成的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 Iα,25-二羟维生素D3对黑素细胞酪氨酸酶、转录因子蛋白及基因的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 3衍生物对黑素细胞内钙离子的影响'>第三部分 维生素D₃衍生物对黑素细胞内钙离子的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 他卡西醇治疗白癜风的自身对照观察
• 病例与方法
• 结果
• 讨论
• 第五部分 他卡西醇联合单频准分子光治疗白癜风的对照研究
• 病例与方法
• 结果
• 讨论
• 论文小结
• 发表论著
• 致谢