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大肠杆菌TrpA-E和Trp operon的克隆与表达

2020-11-23阅读(656)

大肠杆菌TrpA-E和Trp operon的克隆与表达

论文摘要

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，而且在医药、食品、化工、畜牧业及农业等领域有着极其广泛的用途，其中L-色氨酸（L-Trp）作为人体必需的八种氨基酸之一，是氨基酸输液、口服氨基酸制剂所必需的成分。由于国内外饲料工业发展迅速，以及L-色氨酸在医药工业上的用途不断扩大，而国内尚不能大规模生产，因此使其成为一种国际市场上发展前景良好、国内市场需求较大的产品。由于基因工程的迅速发展，通过基因工程的方式来构建高产色氨酸菌株成为一种有效的生产色氨酸的方式。 合成色氨酸所需要酶类的基因E、D、C、B、A等头尾相接串连排列组成结构基因群，受其上游的启动子Ptrp和操纵子σ的调控，调控基因trpR的位置远离P-o-结构基因群，用PCR方法从大肠杆菌K-12中分别得到两个色氨酸操纵子片段，分别保留和没有保留其自身的启动子序列，将这两个DNA片段分别都克隆到T载体上，经过测序发现其核苷酸序列与文献报道的完全一致。然后分别将两种片段克隆到表达载体pBV220和pET22b（+）中去，按照各自不同启动子的诱导表达方式进行诱导表达，并且测定其中邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性，通过分析比较发现带有自身启动子并且克隆到pET22b（+）表达载体上的一种情况较好，因此选定作为改造的对象，通过定点突变的方式突变了弱化子基因内部两个相邻色氨酸密码子，从而提高了操纵子内各个酶的表达量和酶的活性。 本文主要通过对色氨酸操纵子的整体克隆表达，提高色氨酸操纵子内各个酶基因的拷贝数，进而提高它们的酶活，以达到提高色氨酸产量的效果，并且比较了色氨酸操纵子自身启动子的有无对整个基因表达的影响，通过选用不同的表达载体，分析比较了不同强度外源启动子对色氨酸色氨酸操纵子表达的影响，并最终选定了一种最好的情况，对色氨酸自身启动子的弱化子部分进行定点突变，通过改变其二级结构的方式降低其对整个基因表达的阻遏作用，从而提高表达量和酶的活性。 L-色氨酸的合成代谢途径长、调控复杂，因此其生产调节一直都受到影响，通过基因工程和代谢工程相联系构建高产色氨酸工程菌存在着许多困难，需要从

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 目录
  • 第一章 文献综述
  • 1 色氨酸的理化性质
  • 2 L-色氨酸的生理生化作用及用途
  • 3 L-色氨酸的主要生产方法
  • 4 色氨酸的基因工程
  • 5 L-色氨酸的现状及前景展望
  • 第二章 Trp A-E和Trp Operon-pET-22b（+）表达载体的构建与表达
  • 一、材料与方法
  • 1 菌株与质粒
  • 2 培养基
  • 3 实验仪器
  • 4 Trp A-E和Trp operon与克隆载体pGEM-Teasy的连接
  • 5 Trp A-E和Trp operon-pET-22b（+）的构建与表达
  • 二、结果
  • 1 Trp Operon基因的PCR扩增
  • 2 克隆重组质粒Teasy-TrpA-E和Trp operon的构建
  • 3 TrpA-E和Trp operon基因序列测定
  • 4 pET-22b（+）-TrpA-E/pET-22b（+）-Trp operon表达重组质粒的构建
  • 5 pET-22b（+）-TrpA-E/pET-22b（+）-Trp operon的酶切鉴定
  • 6 pET-22b（+）-TrpA-E和pET-22b（+）-Trp operon在E.coli中的表达
  • 7 重组质粒表达产物中的邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性测定
  • 第三章 Trp A-E和Trp operon-pBV220的构建与表达
  • 一、材料与方法
  • 1 菌株与质粒
  • 2 培养基及实验仪器
  • 3 工具酶与试剂
  • 4 E.coli 31884菌种的复苏培养及总DNA的提取
  • 5 PCR引物设计与合成
  • 6 pBV220-TrpA-E和pBV220-Trp operon的构建
  • 7 控制的工程菌的诱导
  • 8 表达产物的电泳分析及蛋白质定量分析
  • 9 粗酶液的制备
  • 10 邻氨基苯甲酸合成酶的活性测定及色氨酸合成酶的活性测定
  • 二、实验结果
  • 1 Trp Operon基因的PCR扩增
  • 2 重组质粒pBV220-TrpA-E和pBV220-Trp operon的构建
  • 3 克隆载体的酶切鉴定
  • 4 TrpA-E和Trp operon基因序列测定
  • 5 pBV220-TrpA-E/pBV220-Trp operon在E.coli中的表达
  • 6 重组质粒表达产物中的邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性测定
  • 第四章 pET-22b（+）-Trp operon的定点突变
  • 一、实验材料与方法
  • 1 实验材料
  • 2 PCR引物设计与合成
  • 3 PCR反应条件的建立
  • 4 处理样品
  • 5 磷酸化反应
  • 6 连接与转化以及筛选阳性克隆
  • 7 蛋白质电泳分析及酶活测定
  • 二、实验结果
  • 1 Trp Operon突变基因的PCR扩增
  • M的构建和序列分析'>2 重组表达质粒pET-22b（+）-Trp OperonM的构建和序列分析
  • 3 重组质粒在E.coli中的表达
  • 4 重组质粒表达产物中的邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性测定
  • 讨论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].饲用L-色氨酸的安全性评价[J]. 中国家禽 2017(22)
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    • [3].稀糖分罐发酵对L-色氨酸发酵的影响[J]. 中国酿造 2018(04)
    • [4].L-色氨酸混菌发酵工艺[J]. 食品与发酵工业 2019(14)
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    • [26].L-色氨酸发酵条件研究[J]. 河北农业科学 2011(03)
    • [27].水/有机溶剂双相体系中色氨酸合成酶酶法合成L-色氨酸[J]. 催化学报 2011(08)
    • [28].膜技术在酶法生产L-色氨酸中去除蛋白质和色素的应用研究[J]. 中国生化药物杂志 2011(06)
    • [29].过表达csrB和tktA强化大肠杆菌生物合成L-色氨酸[J]. 应用与环境生物学报 2015(04)
    • [30].大肠杆菌L-色氨酸合成的代谢流分析[J]. 生物技术通讯 2014(01)

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