论文摘要
目的:构建人巨细胞病毒（HCMV）IE1核酸疫苗pcDNA3.1（-） -IE1,通过免疫BALB/c小鼠,初步研究其产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,为进一步研发HCMV IE1疫苗奠定实验基础。方法:（1）将重组载体pEGFP-C1-IE1用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切与载体pcDNA3.1（-）连接构建重组质粒pcDNA3.1（-）-IE1,双酶切鉴定。（2）将重组质粒pcDNA3.1（-）-IE1转染HeLa细胞,RT-PCR及Western blot测定IE1在真核细胞的表达。（3）将pcDNA3.1（-） -IE1、对照空质粒pcDNA3.1（-）及PBS分别通过肌肉注射8 w龄BALB/c小鼠,隔2 w免疫1次,共免疫4次。（4）末次免疫小鼠2 w后,取小鼠肌肉组织通过PCR法检测IE1基因,免疫组化测定IE1基因在小鼠肌细胞中的表达。（5）末次免疫小鼠2 w后,无菌制备小鼠脾细胞,经PHA刺激后,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清液中IL-4、IL-2、IFN-γ含量;MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,计算刺激指数（SI）。用统计软件SPSS13.0分析实验数据。结果:（1）构建的真核细胞表达载体pcDNA3.1（-）-IE1经双酶切后,小片段约1476 bp,与IE1大小一致。（2） pcDNA3.1（-）-IE1转染HeLa细胞后,RT-PCR检测到约1476 bp片段,与IE1大小相符,Western blot检测到分子量约72 kDa的IE1蛋白。（3）在免疫小鼠肌细胞中,利用PCR检测到约1476 bp片段,与IE1大小一致,即IE1基因在小鼠肌细胞中稳定存在;免疫组化结果显示IE1基因在小鼠肌细胞中表达IE1目的蛋白。（4）核酸疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经PHA刺激后,培养上清液中:IL-4含量为30.47±1.76 pg/mL,与空质粒组（26.88±2.60 pg /mL）和PBS组（25.06±2.60 pg /mL）比较差异有显著性（P < 0.05）;IL-2含量为47.98±2.08 pg/mL,与空质粒组（19.66±2.45 pg/mL）和PBS组（16.06±2.45pg /mL）比较差异有显著性（P < 0.01）;IFN-γ含量为50.47±4.81 pg/mL,与空质粒组（28.24±4.18 pg/mL）和PBS（25.06±4.35 pg /mL）组比较差异有显著性（P < 0.001）。（5）核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经PHA刺激后,SI为3.55±0.48,与空质粒组（1.86±0.23）和PBS组（1.48±0.11）比较差异有显著性（P < 0.001）。结论:（1）成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（-）-IE1,且其能在真核细胞内表达HCMV IE1蛋白。（2） pcDNA3.1（-）-IE1核酸疫苗能在BALB/c小鼠肌细胞中稳定存在,并且能在其肌细胞中表达HCMV IE1蛋白。（3） pcDNA3.1（-）-IE1核酸疫苗可诱导BALB/c小鼠脾细胞分泌IL-4、IL-2、IFN-r和刺激BALB/c小鼠脾细胞增殖。