结核分枝杆菌抗原蛋白的表达、免疫特性分析及在牛结核病检测中的初步应用

论文摘要

结核病（Tuberculosis, TB）主要是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）复合物引起的一类以呼吸系统感染为主的慢性人兽共患传染病病。该复合物主要成员包括主要引起人TB的MTB以及引起牛结核病的牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis, M. bovis）。上世纪80年代以来,由于人口增长、移民、HIV共感染及耐药强毒株广泛传播等因素的影响,TB在世界范围内再次流行。估计全球有20亿人感染,活动性肺结核病人2000余万,且每年新增800-900万TB病例,死亡200万人左右。牛结核病不仅严重影响养牛业的健康发展,同样也会导致部分人TB的发生。作为主要疾病负担和致死因素之一,TB日益成为严重的全球性公共卫生问题并引起国际社会的广泛关注。TB防控需要有效的疫苗和特异性诊断试剂。卡介苗（BCG）作为人类唯一使用的抗TB疫苗在儿童TB和弥散性TB中效果良好,但对成人肺结核保护效果不佳（0-80%）,且BCG免疫会干扰TB的皮试诊断。因此,鉴定病原特异性的抗原对发展新型抗TB保护性疫苗和特异性诊断试剂显得尤为必要。比较基因组学等的发展提供了大量特异性抗原信息,它们的免疫特性评价常用于鉴定新型抗TB疫苗候选抗原和诊断试剂。本研究应用原核系统表达和纯化了7种结核分枝杆菌抗原蛋白,对其中5种重组蛋白进行了免疫特性分析,同时利用间接ELISA方法,评价和比较其在牛结核病血清学诊断中的潜能。1.结核分枝杆菌抗原蛋白的表达和鉴定参考比较基因组学信息,选取6种MTB抗原蛋白（MPT64、MPT63、MPT83、CFP32、 MPT51和MPT53）,首先通过PCR扩增相应的编码基因序列,经克隆筛选和测序鉴定正确后,利用pET30a质粒构建原核表达载体。将鉴定正确的重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,筛选获得阳性转化子,再以IPTG诱导表达,对以胞内可溶性表达的上述6种抗原蛋白及ESAT-CFP10融合蛋白（本室保存）进行亲和层析纯化。定量测定和分析纯化产物浓度和纯度,并通过Western blotting试验分析融合蛋白的免疫原性。SDS-PAGE结果显示诱导后各目的蛋白均成功表达,且主要以可溶形式存在,灰度分析显示各目的蛋白表达量约占裂解上清总蛋白的30%左右（分别为34.8%、32.7%、27.4%、27.8%、30.6%、31.5%和30.2%）,而纯化后融合蛋白的纯度,除MPT53（69.8%）外其余均在90%以上（其中MPT64为92.7%、MPT63为95.6%、MPT83为96.6%、CFP32为91.8%、MPT51为92.3%、ESAT-6-CFP10为96.6%）。Western blotting结果显示,在各融合蛋白处均出现特异性目的条带,表明其具有较好的免疫反应性。2.五种融合蛋白的细胞免疫学特性分析以ESAT-CFP10、MPT64、MPT63、MPT83、CFP32五种融合蛋白分别皮下免疫C57BL/6小鼠,二免两周后取脾脏淋巴细胞进行免疫学测定。将淋巴细胞直接标记PE-CD4/CD69-FITC和APC-CD8α/CD69-FITC利用流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞表面CD69的表达,结果显示五种蛋白均能引起两类淋巴细胞亚群CD69表达量上调,且MPT63和ESAT-6-CFP10刺激CD4+T细胞表达CD69的能力显著高于其他几种蛋白。利用ELISPOT试验分析五种蛋白作刺激剂活化淋巴细胞分泌IFN-y和IL-4能力,结果显示ESAT-6-CFP10与MPT63刺激细胞产生IFN-γ的能力最强,ESAT-6-CFP10和CFP32刺激细胞产生IL-4的能力最强,而MPT64刺激细胞产生IFN-γ和IL-4的能力在所有蛋白中最弱。比较同一种蛋白活化特异淋巴细胞产生IFN-y和IL-4的能力,结果显示ESAT-6-CFP10和MPT63蛋白刺激细胞分泌IFN-γ的能力显著大于IL-4,呈Th1免疫应答趋势；MPT83和MPT64蛋白则相反,呈Th2免疫应答趋势；而CFP32蛋白刺激细胞分泌两种细胞因子的能力相当,呈现Thl/Th2免疫平衡趋势。同时,通过夹心ELISA方法对各融合蛋白刺激后的细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量进行定量分析,也得到与ELISPOT试验相似的结果。3.五种融合蛋白的牛结核诊断价值评价在淋巴细胞增殖试验中,以ESAT-CFP10、MPT64、MPT63、MPT83、CFP32五种融合蛋白作为刺激原,与PPD同步刺激临床采集的25份奶牛尾静脉血,再用IFN-y试剂盒检测其活化抗原特异性细胞产生IFN-y的水平。均值和线性回归分析的结果显示5种蛋白中ESAT-6-CFP10刺激IFN-y的产生与Bovine PPD的相关性最高,MPT63蛋白的相关性次之。以0.280作为蛋白刺激阳性反应的切割值,其阳性率与试剂盒阳性符合率由高到低依次为ESAT-6-CFP10、MPT63、MPT83、MPT64和CFP32。同时以上述5种蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA方法,通过检测临床牛血浆上清中特异性抗体以评价它们用于牛结核血清学诊断的潜在应用价值。各蛋白的阳性检出率如下：MPT64为8.40%（20/238）,MPT63为9.66%（23/238）,MPT83为17.65%（42/238）, CFP32为11.34%（27/238）,ESAT-6-CFP10为2.52%（6/238）,显示MPT83和CFP32血清学检测的敏感性较高。将各蛋白的间接ELISA结果与IFN-γ试剂盒的结果进行比较,结果显示两种方法的阴性符合率均值超过90%（MPT64为96.84%、MPT63为94.68%、MPT83为90.43%、CFP32为90.43%、ESAT-6-CFP10为100%）,说明这些蛋白的血清学ELISA方法用于牛结核的辅助诊断具有较高特异性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 第一章 结核病病原及其抗原研究概述
• 1 结核病病原和流行现状
• 1.1 TB病原概述
• 1.2 TB和牛结核病的流行现状
• 2 牛分枝杆菌后基因组学研究
• 2.1 M.tb和M bovis基因组概况
• 2.2 M.bovis括比较基因组学
• 2.3 蛋白质组学
• 3 牛结核病特异性诊断抗原
• 3.1 牛结核病的血清学诊断
• 3.2 bTB特异性诊断抗原
• 4 结语
• 参考文献
• 第二章 结核分枝杆菌抗原蛋白的原核表达和鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 目的基因扩增和重组质粒的鉴定
• 2.2 融合蛋白纯化和定量分析
• 2.3 融合蛋白Western blotting分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 5种融合蛋白细胞免疫学特性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 T细胞表面分子CD69的表达变化
• 2.2 ELISPOT检测特异性IFN-γ和IL-4分泌细胞
• 2.3 夹心ELISA检测IFN-γ和IL-4含量
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 5种融合蛋白的牛结核病诊断价值评价
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 牛IFN-γ刺激原的比较试验
• 2.2 间接ELISA血清学检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢