千年桐硬脂酸脱饱和酶、油酸脱氢酶基因克隆及真菌遗传转化研究

论文摘要

生物柴油是一种可再生清洁能源。我国丰富的油料植物资源是制造生物柴油的理想原料,但以油菜（Brassica campestris）、大豆（Glycine max）等油料作物和木本油料种子为材料制造生物柴油,存在原料不足、成本高的问题。以微生物为原料可以通过生物反应器达到工业化生产的目的,从而解决生物质能源的材料来源问题,但现有的产油菌株存在产油率低、油脂成分复杂等问题。近年来,随着生物工程技术的发展,人们可以通过分子生物学方法来调控脂肪酸代谢途径,进而得到符合需求的功能性油脂。本研究通过RT-PCR方法,从种子含油量高的木本油料树种——千年桐（Vernicia montana）中成功克隆到植物单不饱和脂肪酸合成的两个关键基因VeSAD和VeFAD2cDNA编码区全长,长度分别为1191bp和1152bp,在GenBank上成功登录（登录号分别为:EU072353、EF152993）,并用分子生物学软件对其编码框的结构和功能进行分析。研究发现VeSAD编码蛋白序列与麻疯树（Jatropha curcas）、蓖麻（Ricinus communis）、油菜的同源性均达80%以上。功能区分析显示该酶具有可溶性脂酰-ACP脱饱和酶特有的保守区域,而不具有其它膜结合蛋白酶的功能区,属于△9硬脂酸脱饱和酶类。千年桐VeFAD2编码蛋白与本属植物油桐（Vernicia forddi）同源性为100%,与麻疯树为90%,与其它油料树种同源性也达81.2%左右,编码蛋白是个相对保守的多肽。对FAD2基因编码蛋白的结构及功能分析发现,VeFAD2蛋白三维结构不但含有脂肪酸脱饱和酶所共有的保守功能区域结构,还有△12脱饱和酶特有的功能区,属于油酸脱氢酶类。根据两个基因在脂肪酸代谢中的催化作用,构建VeSAD基因在真菌中的正义表达载体pCAM2300-sad,VeFAD2基因的反义表达载体pBI121-fad2。通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法进行真菌遗传转化,与以往的原生质体-PEG介导法、醋酸锂转化法、电击转化法等相比,具有转化效率高、操作方便的优点。本研究对农杆菌介导的丝状真菌和酵母遗传转化中一些关键因子进行研究,最终建立适合少根根霉（Rhizopus arrhizus）和浅白隐球酵母（Cryptococcus albidus）转化的较佳体系。少根根霉孢子浓度与根癌农杆菌菌液浓度比例在1:50-100,21℃共培养18 h后转到选择培养基上筛选,没有转化的菌丝因缺少营养逐渐死去,初选得到的根霉菌丝密度较小,便于后续鉴定。浅白隐球酵母与根癌农杆菌菌液浓度比例为1:200-300,25℃共培养35 h后。在选择培养基上观察得到的酵母菌落数目较多,容易进行后期的转化鉴定。本结论为下一步研究产油真菌奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究目的和意义
• 1.1.3 项目来源与经费支持
• 1.2 国内外研究现状与评述
• 1.2.1 脂酰ACP（Acyl –ACP）脱饱和酶
• 1.2.2 脂酰脂（Acyl-lipid）脱饱和酶
• 1.2.3 千年桐的栽培历史与现状
• 1.2.4 产油微生物的脂肪酸代谢途径及脂肪酸组成
• 1.2.5 真菌遗传转化研究进展
• 1.2.6 研究评述
• 1.3 研究目标和主要研究内容
• 1.3.1 研究目标
• 1.3.2 主要研究内容
• 1.4 研究技术路线
• 第二章 千年桐硬脂酸脱饱和酶基因（VESAD）CDNA 克隆、测序分析、表达载体构建及根癌农杆菌转化
• 2.1 实验材料及主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA 提取
• 2.2.2 反转录
• 2.2.3 PCR 扩增SAD 基因cDNA 编码区全长
• 2.2.4 扩增产物的克隆和测序
• 2.2.5 正义表达载体pCAM2300-sad 的构建
• 2.2.6 质粒转化根癌农杆菌
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA 提取及RT-PCR 反应
• 2.3.2 阳性克隆测序及分析
• 2.3.3 表达载体pCAM2300-sad 的构建及验证
• 2.3.4 根癌农杆菌阳性转化子的获得
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 千年桐油酸脱氢酶基因FAD2 CDNA 克隆、测序分析、表达载体构建及根癌农杆菌转化
• 3.1 实验材料及主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 总RNA 提取
• 3.2.2 反转录
• 3.2.3 PCR 扩增FAD2 基因cDNA 编码区全长序列
• 3.2.4 扩增产物的克隆和测序
• 3.2.5 反义表达载体p81121-fad2 的构建及酶切验证
• 3.2.6 质粒p81121-fad2 转化根癌农杆菌
• 3.3 结果与分析
• 2 基因cDNA 克隆、测序及分析'>3.3.1 RT-PCR 反应及VeFAD₂ 基因cDNA 克隆、测序及分析
• 2 基因反义表达载体p81121-fad2 的构建及酶切验证'>3.3.2 VeFAD₂ 基因反义表达载体p81121-fad2 的构建及酶切验证
• 3.3.3 根癌农杆菌阳性转化子的获得
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株及主要试剂
• 4.1.2 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化
• 4.2.2 根癌农杆菌介导的酵母遗传转化
• 4.2.3 抗生素浓度实验
• 4.2.4 转化条件优化策略
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 选择性抗生素（卡那霉素）浓度实验
• 4.3.2 抑菌性抗生素浓度实验
• 4.3.3 转化条件优化结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 本文主要结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 在读期间的学术研究
• 致谢