百日咳腺苷酸环化酶毒素基因的克隆、原核表达、纯化及初步鉴定

论文摘要

目的通过对百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因（cyaA）及cyaC基因进行扩增,构建重组质粒pET30a/cyaA、pET30a/cyaC并转化进入大肠杆菌DH5α中,经筛选保存阳性克隆菌。进一步构建双基因重组质粒pET30a/cyaCA。重组质粒pET30a/cyaA转化大肠杆菌BL21（DE3）,并使重组百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因cyaA在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。对表达的目的蛋白进行初步的纯化,得到纯度达90%左右的重组蛋白,并对重组蛋白进行初步的鉴定。这些为对重组百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素（CyaA, ACT）作进一步的应用研究奠定基础。方法用试剂盒提取百日咳鲍特菌CS株的总DNA;根据GenBank收录的百日咳鲍特菌腺苷酸环化酶毒素基因cyaA、cyaC基因序列,设计引物并送生物公司合成;以所提取的总DNA为模板,PCR扩增出cyaA、cyaC基因。对扩增片段和质粒进行酶切后连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂布于卡那平板,37℃培养过夜,挑取若干菌落少量培养,经PCR扩增鉴定及提取质粒后进行质粒酶切鉴定,阳性克隆产物送生物公司测序。测序结果应用DNAStar软件进行序列拼接与分析。所得序列在NCBI中进行Blast分析。把以pET30a/cyaA为模板PCR扩增出的,带有质粒T7启动子的cyaA全片段连接于质粒pET30a/cyaC上,同上方法构建了重组质粒pET30a/cyaCA。提取阳性克隆菌质粒pET30a/cyaA,转化大肠杆菌BL21（DE3）,涂布于卡那平板,37℃培养过夜,挑取若干菌落少量培养,PCR扩增鉴定及提取质粒后对该质粒进行酶切鉴定。对阳性转化菌进行少量培养,并用IPTG诱导表达,SDS-凝胶电泳检测目的蛋白表达情况。对阳性转化菌进行大量培养,IPTG诱导表达后对其进行纯化前处理:超声破碎菌体、超声不溶物溶解、SDS-凝胶电泳检测目的蛋白表达形式。用透析液透析待纯化液体,上DEAE阴离子交换柱纯化蛋白,先用A液（2M urea, 20mM Tris, pH 8.0）洗柱至A280达基线水平,再用9%B液（2M urea, 2M NaCl, 20mM Tris, pH 8.0）洗脱杂蛋白,最后用40%B液洗脱目的蛋白,收集洗脱峰。SDS-凝胶电泳检测洗脱峰含目的蛋白情况,浓缩纯化的重组蛋白并分析其纯度。用全细胞百白破疫苗（wPV）、无细胞百白破疫苗（aPV）及生理盐水免疫NIH小鼠,心脏采血后获得血清。以纯化的重组百日咳CyaA包被96孔板,免疫后小鼠血清作为一抗,采用间接ELISA法检测重组百日咳CyaA的反应原性。此外,重组百日咳CyaA经SDS-凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜,以免疫后小鼠血清作为一抗进行Western Blot（WB）检测,进一步检测重组百日咳CyaA的反应活性。此外,用学龄前儿童wPV免疫前后血清作一抗对重组CyaA进行ELISA和WB检测。结果成功克隆了百日咳腺苷酸环化酶毒素cyaA基因,其序列已向GenBank提交并被收录,序列号为GQ370813。在原核细胞中表达了重组百日咳CyaA,经初步纯化,重组蛋白的纯度达90%左右,浓缩后蛋白浓度为0.83mg/ml。经ELISA检测,全细胞百白破疫苗免疫组血清的抗体浓度水平明显高于无细胞百白破疫苗和生理盐水免疫组（p<0.05）,而无细胞百白破疫苗免疫组血清抗体浓度水平与生理盐水免疫组的无明显差异（p>0.05）。Western Blot检测结果表明,全细胞百白破疫苗免疫血清组在预期的位置有明显的显色条带,无细胞百白破疫苗免疫血清组在预期位置显色条带较弱,而生理盐水免疫血清组则没有显色条带出现。重组CyaA与学龄前儿童wPV免疫后血清在ELISA及WB检测中均有较强的反应。结论在大肠杆菌中成功地克隆了百日咳腺苷酸环化酶毒素基因cyaA,并构建了其原核表达体系。摸索出重组百日咳腺苷酸环化酶毒素蛋白的初步纯化条件,并对该重组蛋白进行了初步的鉴定,证明其具有良好的反应原性。为对其作进一步的应用研究奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 序言
• 第一章 百日咳腺苷酸环化酶毒素基因的克隆
• 序言
• 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要试剂的配制
• 2. 方法
• 2.1 百日咳杆菌 CS 菌株全基因组 DNA 的制备
• 2.2 百日咳杆菌 CS 菌株cyaA 基因的克隆
• 2.3 百日咳杆菌 CS 菌株cyaA 和cyaC 双基因克隆
• 结果
• 1. 百日咳杆菌CS 菌株cyaA 基因的克隆
• 1.1 CS 菌株cyaA 基因的PCR 扩增
• 1.2 CS 菌株cyaA 基因的克隆及鉴定
• 1.3 cyaA 基因的测序和序列比对
• 2. 百日咳杆菌CS 菌株cyaC+cyaA 双基因的克隆
• 2.1 百日咳杆菌 CS 菌株cyaC 基因的克隆
• 2.2 百日咳杆菌 CS 菌株cyaC+cyaA 双基因的克隆
• 讨论
• 第二章 百日咳腺苷酸环化酶毒素基因的原核表达及初步纯化
• 序言
• 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 菌株
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要试剂的配制
• 2. 方法
• 2.1 百日咳cyaA 基因的原核表达
• 2.2 重组蛋白 CyaA 的初步纯化
• 结果
• 1. 重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达及存在形式
• 2. 重组蛋白表达优化
• 3. 阴离子交换柱纯化重组蛋白CyaA
• 4. 浓缩纯化重组蛋白CyaA 的浓度测定
• 讨论
• 第三章 重组腺苷酸环化酶毒素的初步鉴定
• 序言
• 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2. 方法
• 2.1 动物实验
• 2.2 检测方案
• 2.3 用全细胞百白破疫苗免疫前后人血清检测重组 CyaA 的抗原性
• 结果
• 1. 小鼠血清检测重组蛋白CyaA 抗原性
• 2. 人血清检测重组蛋白CyaA 抗原性
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录一 基因序列
• 附录二 英文缩略词表
• 附录三 文献综述
• 附录四 攻读学位期间发表的论文
• 致谢