8-iso-PGF2a试剂盒的制备及在新生儿HIE病情评估中的应用

论文摘要

目的:制备和鉴定抗8-异前列腺素（8-iso-prostaglandin F 2alpha,8-iso-PGF2α）单克隆抗体;制备8-iso-PGF2α测定试剂盒（ELISA）;应用该试剂盒测定缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）新生儿尿8-iso-PGF2α水平。 方法:利用碳二亚胺法（EDC）连接半抗原8-iso-PGF2α和载体蛋白BSA/OVA,免疫BALB/C小鼠,将免疫成功的小鼠脾细胞与SP2/O融合后利用间接ELISA筛选出阳性克隆并扩大培养,阳性克隆制备腹水后进行提纯。应用辣根过氧化物酶标记8-iso-PGF2α,制备ELISA法测定试剂盒,并测定126例正常新生儿和151例HIE患儿尿8-iso-PGF2α含量。 结果:获得一株稳持续定分泌抗8-iso-PGF2α单克隆抗体的细胞株。ELISA试剂盒中的8-iso-PGF2α抗体包被浓度为1μg/ml,温育时间为30分钟,Cutoff值为0.14+NC,所需样本量为100μl,试剂盒37℃放置7天OD450值无明显变化。正常新生儿尿8-iso-PGF2α水平为27.4±9.8ng/mmol·Cr,而轻、中和重度HIE患儿分别为65.3±13.2、154.6±31.6和241.7±41.0 ng/mmol·Cr,差异有统计学意义（p<0.01）;以尿8-iso-PGF2α47.0、91.7和217.5ng/mmol·Cr作为区分正常与轻度、轻度与中度、中度与重度HIE的界限,其敏感性和特异性分别为95.2%和99.2%、100%和95.2%、65.8%和100%。 结论:应用抗体工程技术可获得8-iso-PGF2α单克隆抗体。应用8-iso-PGF2α试剂盒（ELISA）的稳定性好,可准确测定新生儿尿8-iso-PGF2α水平,是一项评估HIE患儿病情可靠而简便的生化指标。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 研究意义
• 1.2 8-iso-PGF2α的代谢及生物学特性
• 1.3 8-iso-PGF2α的测定方法
• 1.4 8-iso-PGF2α测定的临床意义
• 1.4.1 心血管系统疾病
• 1.4.2 神经系统疾病
• 1.4.3 呼吸系统疾病
• 1.4.4 其它系统疾病
• 1.5 单克隆抗体
• 1.6 杂交瘤技术的概念与分类
• 1.7 单克隆抗体的概念及特性
• 1.8 本试验中抗原的特殊性
• 第二章 8-iso-PGF2α多克隆抗体的制备
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要材料及试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要缓冲液及其配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 抗原的制备
• 2.2.2 免疫小鼠
• 2.2.3 试血和采血
• 2.2.4 抗血清的保存
• 2.3 结果与讨论
• 2.4 小结
• 第三章 细胞融合
• 3.1 细胞融合技术
• 3.2 HAT选择性培养
• 3.3 主要器材
• 3.4 主要设备
• 3.5 主要试剂
• 3.6 主要试剂的配制
• 3.7 试验方法
• 3.7.1 饲养细胞的制备
• 3.7.1.1 器材和试剂
• 3.7.1.2 操作方法
• 3.7.2 细胞融合
• 3.7.2.1 器材和试剂
• 3.7.2.2 操作方法
• 3.8 结果与讨论
• 3.9 小结
• 第四章 8-iso-PGF2α单克隆抗体的筛选和检测
• 4.1 免疫酶技术
• 4.1.1 原理
• 4.1.2 器材和试剂
• 4.1.3 实验方法
• 4.2 冻存阳性克隆
• 4.3 有限稀释法克隆化
• 4.4 结果与讨论
• 4.5 小结
• 第五章 腹水型单克隆抗体的生产与纯化
• 5.1 腹水的制备
• 5.1.1 器材与试剂
• 5.1.2 方法
• 5.2 腹水型单克隆抗体的纯化
• 5.2.1 腹水的预处理
• 5.2.2 硫酸铵盐法初提单克隆抗体
• 5.3 结果与讨论
• 5.4 小结
• 第六章 8-iso-PGF2α测定试剂盒（ELISA）的制备
• 6.1 前言
• 6.2 原理及用途
• 6.3 材料与方法
• 6.4 试剂组成
• 6.5 试剂参数确定
• 6.6 试剂盒使用方法
• 6.7 讨论
• 第七章 8-iso-PGF2α在新生儿HIE病情评估中的价值
• 7.1 研究背景
• 7.2 对象与方法
• 7.2.1 临床资料
• 7.2.2 研究方法
• 7.3 结果
• 7.3.1 正常与HIE患儿尿8-iso-PGF2α水平
• 7.3.2 尿8-iso-PGF2α评估新生儿HIE病情的准确性
• 7.4 讨论
• 参考文献
• 在校期间发表的论文
• 致谢