GFP在南方根结线虫（Meloidogyne incogita）拮抗菌Alcaligenes faecalis研究中的应用

论文题目: GFP在南方根结线虫（Meloidogyne incogita）拮抗菌Alcaligenes faecalis研究中的应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 周莉娟

导师: 谢联辉

关键词: 标记基因,绿色荧光蛋白,粪产碱菌,标记菌,拮抗,南方根结线虫,根际,定殖

文献来源: 福建农林大学

发表年度: 2005

论文摘要: 植物寄生线虫是农业生产中重要的传染性病原之一,使作物减产从而给农业生产带来重大损失。至今对线虫的防治还是以化学杀线剂为主,由于化学杀线剂的高毒、高残留对人类健康及环境造成潜在威胁,因此发展以微生物为主的生物杀线剂成为未来的发展方向。BC2000就是一株分离至根际土壤的线虫拮抗菌株。 一系列室内和田间试验结果表明,BC2000作为植物生长促进剂和抗线虫生防菌剂具有潜在的应用价值,为了解该菌株在环境中的定殖、活动能力及作用方式,利用一个特殊标记对该菌株进行监测是很有必要的,而编码绿色荧光蛋白(GFP)的gfp基因就是一个最具应用前景的标记物。本研究以GFP作为拮抗菌BC2000的荧光标记物,通过标记菌表达的绿色荧光来监测它在根际及植物组织的定殖活动,并对标记菌株的生物学特性及生防功能进行研究。 用16S rRNA基因克隆、测序及序列分析比对的方法,鉴定该菌株为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)。进而利用一个带gfp和luxAB双标记基因的miniTn5转座载体,用电转化法将这几个基因插入BC2000的基因组中,利用gfp基因表达后菌落在立体荧光显微镜下发出的绿色荧光,得到一个高效表达GFP的标记菌,命名为BC2001。标记菌的基因组DNA用gfp基因的特异性引物进行PCR和Southern杂交鉴定,同时将其16S rRNA基因克隆、测序并与出发菌BC2000的16s rRNA基因序列进行两两比对,结果证明该标记菌确实是出发菌BC2000经电转化后在基因组中整合了gfp基因的突变菌株,同时通过荧光素酶活性测定证实另一个标记基因luxAB在BC2001中也得到了很好的表达。 标记菌BC2001生理生化特性研究结果表明,与出发菌BC2000比较,菌体和菌落形态没有差异,但菌株的生长出现滞后现象;虽然BC2001对温度的敏感性增强,但两种菌株生长的温度和pH范围没有变化,30℃的温度和pH7.0是这两种菌株生长的最适宜温度和酸碱度,而且最有利于标记菌BC2001中GFP的表达。对标记菌BC2001中GFP表达稳定性进行试验的结果,BC2001连续转接10次后外源基因gfp在选择性和非选择性LB平板中表

论文目录:

独创性声明

论文使用授权的说明

中文摘要

英文摘要

前言

1 标记基因及其在微生物分子生态学研究中的应用

1.1 标记基因概念

1.2 在微生物分子生态学研究中应用的标记基因种类

1.2.1 抗生素抗性基因

1.2.2 重金属抗性基因

1.2.3 冰核形成基因

1.2.4 生色基因

1.2.5 生物发光基因

1.2.6 绿色荧光蛋白基因

1.3 绿色荧光蛋白(GFP)及其在微生物分子生态学中的应用

1.3.1 GFP的结构及发光特性

1.3.2 GFP的突变体

1.3.3 GFP的特点

1.3.4 GFP在微生物中的转化及检测方法

1.3.5 GFP在微生物分子生态学中的应用

1.3.6 展望

2 根际细菌防治植物线虫研究进展

2.1 植物线虫发生与危害

2.2 植物线虫的生物防治

2.2.1 植物线虫的防治策略

2.2.2 植物线虫的生防研究概况

2.3 植物根际细菌对线虫的生物防治

2.3.1 植物根际及根际细菌

2.3.2 抗线虫根际细菌种类

2.3.3 影响根际细菌抗线虫功能的因素

2.3.4 对根际细菌抗线虫机理的推测

3 本项目的研究背景及研究内容

3.1 研究背景

3.2 本项目的研究内容

第一章 线虫拮抗菌BC2000的分子鉴定及gfp/luxAB双基因标记

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒及培养基

1.2 试剂及仪器

1.3 BC2000 16S rRNA基因克隆及测序

1.3.1 细菌基因组DNA提取

1.3.2 PCR扩增及产物纯化

1.3.3 连接反应

1.3.4 序列分析及GenBank中的注册号

1.4 抗生素抗性分析

1.5 BC2000电转化试验

1.5.1 质粒提取

1.5.2 质粒DNA的定量分析

1.5.3 NotI酶切鉴定

1.5.4 BC2000感受态细胞的制备

1.5.5 电转化

1.5.6 阳性转化子的荧光检测

1.6 标记菌的PCR鉴定

1.6.1 细菌基因组DNA提取

1.6.2 PCR扩增

1.7 Southern杂交检测

1.7.1 DNA提取、酶切及电泳

1.7.2 转膜及固定

1.7.3 探针制备及杂交检测

1.8 荧光素酶活性测定

1.9 标记菌BC2001的分子鉴定

2 结果与分析

2.1 BC200016S rRNA基因克隆及测序

2.2 抗生素抗性分析

2.3 gfp／luxAB基因转化粪产碱菌BC2000

2.4 标记菌BC2001的PCR鉴定

2.5 Southern杂交检测

2.6 荧光素酶活性检测

2.7 标记菌BC2001的分子鉴定

3 讨论

第二章 GFP标记菌BC2001的生物学特性研究

1 材料和方法

1.1 供试菌株、培养方法及主要仪器

1.2 菌落形态及菌体形态观察

1.2.1 菌落形态观察

1.2.2 激光共聚焦显微镜观察细胞形态

1.2.3 电镜观察

1.2.4 流式细胞仪分析法

1.3 GFP标记对菌株生长的影响

1.4 不同温度对菌株生长及GFP表达的影响

1.5 不同pH值对菌株生长及GFP表达的影响

1.6 标记菌株BC2001中GFP表达稳定性

1.7 标记菌在不同温度土壤中的存活能力

1.7.1 土壤接种方法取样

1.7.2 从土壤中收集细菌的方法

1.7.3 平板计数

1.7.4 流式细胞仪检测土壤分离细菌的荧光强度

2 结果与分析

2.1 菌落形态和菌体形态观察

2.2 外源基因标记对菌株生长的影响

2.3 酸碱度对菌株生长及GFP表达的影响

2.4 不同温度对菌株生长及GFP表达的影响

2.5 标记菌株BC2001中GFP表达稳定性

2.6 标记菌株BC2001在不同温度土壤中的存活能力

3 讨论

第三章 GFP标记菌BC2001的防病促生功能及其在根际的定殖研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 主要仪器

1.3 GFP标记菌BC2001的生防及促生功能研究

1.3.1 BC2001拮抗线虫的室内毒力实验

1.3.2 盆栽试验

1.4 GFP标记菌BC2001在土壤及根际的定殖研究

1.4.1 荧光显微镜观察GFP标记菌BC2001在土壤中的定殖

1.4.2 立体荧光显微镜观察GFP标记菌BC2001在番茄根部的定殖

1.4.3 激光共聚焦显微镜观察

1.4.4 GFP标记菌在盆栽番茄根际及植物组织内的定殖监测

2 结果与分析

2.1 BC2001防病促生功能研究

2.1.1 BC2001对M.incotiga卵的抑制作用及形态学观察

2.1.2 BC2001对M.incotiga二龄幼虫的抑制作用及形态学观

2.1.3 BC2001促生功能研究

2.1.4 标记菌BC2001对番茄根结线虫侵染的影响

2.2 GFP标记菌在土壤及植物组织内的显微观察

2.2.1 荧光显微镜及立体荧光显微观察土壤及番茄根表的GFP标记菌BC2001

2.2.2 激光共聚焦显微镜观察GFP标记菌BC2001在番茄种子及根、茎部的定殖

2.3 平板计数法对GFP标记菌在番茄根际及组织内的定殖监测

2.3.1 种子接种对GFP标记菌BC2001在番茄根际及植物组织内定殖的影响

2.3.2 苗期浇菌对GFP标记菌BC2001在番茄根际及植物组织内定殖的影响

2.4 PCR方法检测BC2001在番茄中的定殖情况

3 讨论

3.1 GFP标记菌BC2001的防病促生功能研究

3.2 GFP标记菌株的定殖研究

小结

有待进一步研究的内容

参考文献

附录一：彩图

附录二：缩写词和英汉对照

附录三：本研究使用的试剂与溶液的配制

致谢

发布时间: 2005-09-27

参考文献

• [1].酵母拮抗菌的抑病机理及生防效力改良的研究[D]. 万亚坤.中国科学院研究生院（植物研究所）2004
• [2].酵母拮抗菌的抑病效力、规模化培养及相关机理研究[D]. 王友升.中国科学院研究生院（植物研究所）2005
• [3].拮抗菌和化学物质的抑病机理及果实抗病相关基因的克隆[D]. 姚红杰.中国科学院研究生院（植物研究所）2005
• [4].海藻糖提高酵母拮抗菌生活力和生防效力的作用机制[D]. 李博强.中国科学院研究生院（植物研究所）2006
• [5].果实对酵母拮抗菌和外源水杨酸诱导的抗病性应答机理[D]. 产祝龙.中国科学院研究生院（植物研究所）2006
• [6].拮抗菌对冬枣采后病害的生物防治[D]. 薛梦林.西北农林科技大学2006
• [7].复合拮抗菌发酵液对香蕉枯萎病及土壤微生物区系的影响[D]. 周登博.海南大学2013
• [8].五味子内生细菌研究[D]. 金岩.吉林农业大学2015
• [9].海洋中稻瘟病拮抗菌的分离、发酵优化及其活性成分分析[D]. 靳西彪.四川农业大学2012
• [10].抗甜瓜枯萎病生防菌及其生物有机肥的生防机理研究[D]. 赵青云.南京农业大学2011

相关论文

• [1].绿木霉（TRICHODERMA VIRENS）TY009菌株胶霉毒毒素分离纯化及绿色荧光蛋白标记研究[D]. 刘路宁.浙江大学2008
• [2].绿色荧光蛋白基因gfp在华癸中生根瘤菌与紫云英共生固氮体系研究中的应用[D]. 史巧娟.华中农业大学2000
• [3].植物病原拮抗细菌的发酵条件作用机制及定殖规律的研究[D]. 张昕.浙江大学2005
• [4].苏去金杆菌的分离、cry/cyt基因鉴定及杀线虫活性的研究[D]. 罗兰.西北农林科技大学2005
• [5].土壤线虫对养分循环和作物生长的影响及机理[D]. 李辉信.南京农业大学1998
• [6].芽孢杆菌（Bacillus spp.）拮抗菌株的筛选及TasA基因研究[D]. 刘伟.福建农林大学2006
• [7].根结线虫寄生真菌资源与淡紫拟青霉PL89的研究[D]. 肖顺.福建农林大学2006
• [8].花生根结线虫致病相关基因的克隆与鉴定及分支酸变位酶基因功能的研究[D]. 龙海.南京农业大学2006
• [9].水稻根部线虫鉴定及潜根线虫根结线虫对水稻的致病性[D]. 谢志成.福建农林大学2007
• [10].番茄和辣椒抗根结线虫基因的克隆与鉴定[D]. 陈儒钢.华中农业大学2006

标签：标记基因论文;  绿色荧光蛋白论文;  粪产碱菌论文;  标记菌论文;  拮抗论文;  南方根结线虫论文;  根际论文;  定殖论文;