纤维素酶工程菌的构建及表达

论文摘要

纤维素属于可再生自然资源,是生物界最重要的碳源物质,每年由光合作用产生的植物干质量约220亿吨,其中纤维素占50%。我国每年仅作物秸秆的纤维产量就达2亿吨以上。利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径之一,对解决环境污染、食品短缺、能源危机和人类社会的可持续发展具有重大的现实意义。绿色木霉能产生大量的胞外纤维素酶,酶系较完全,主要包括:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,据报道在这几种类型的酶协同作用下能对纤维素进行完全降解,并且对结晶纤维素也有较好的酶解活性。纤维素酶属诱导型酶类,其多个酶组分的表达调控是一个非常复杂的过程,其中外切葡聚糖酶（CBHⅡ）具有关键的作用。当CBHⅡ基因缺失时,会影响纤维素酶系其它酶的表达,而缺失其他基因时,只单独影响自身的表达。另有研究表明CBHⅡ是纤维素酶系统中最先表达的酶,其表达产物进一步诱导其他纤维素酶基因的表达,但CBHⅡ基因的表达受葡萄糖的抑制,要提高绿色木霉的产纤维素酶能力可以通过对绿色木霉CBHⅡ基因进行克隆,将其克隆到不受葡萄糖抑制的真核启动子下游,构建高效表达载体,使CBHⅡ基因不再受到培养基中葡萄糖的抑制而得到高效表达,从而促进其他纤维素酶基因的协同表达,大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能力。本研究根据绿色木酶cDNA序列设计合成引物,PCR扩增CBHⅡ基因序列,将完整的目的基因与表达载体pUT连接,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组质粒pUT-CBH。再将pUT-CBH重组质粒与强启动子PKI A片段以合适的比例连接,转入大肠杆菌DH5α中,获得具有PKI A强启动子的重组表达质粒pUT-CE。构建的重组表达质粒采用电穿孔法转化回原宿主菌绿色木霉,得到阳性转化子。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纤维素酶基因在原宿主菌中的表达,对阳性转化子用Ben A显性标记进行初筛后进一步采用刚果红染色法复筛,并进行液体摇瓶培养,检测发酵液酶活力以及遗传稳定性。本研究获得了一株表达率高、酶活力强和遗传稳定的重组纤维素酶工程菌pUT-CE-H1。实验表明纤维素酶工程菌在50℃、200rpm培养72小时,总酶活达到45u/ml/h,Cx酶活达到1600u/ml/h,C1酶活达到160u/ml/（24h）,葡萄糖苷酶活达到15u/ml/h。纤维素酶工程菌的获得,为研究绿色木霉纤维素酶基因在同源转化中的表达及工程菌的酶学特性提供了重要的材料。通过对阳性转化子的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测、阳性转化子与原宿主菌发酵培养液的酶活比较和重组酶的酶学特性分析,证明了同源转化后重组质粒正确表达了绿色木霉的纤维素酶基因,也证明了绿色木霉纤维素酶工程菌在表达率、酶活力和遗传稳定性上对比原宿主菌都有显著提高,并且工程菌表达分泌的纤维素酶具有相应的生物学酶活特性,为进一步研究绿色木霉基因的同源转化和对纤维素的完全降解提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 纤维素及纤维素酶概述
• 1.1.1 纤维素的化学组成及结构
• 1.1.2 纤维素酶（系）的组成
• 1.1.3 纤维素酶的分子结构
• 1.1.4 纤维素酶（系）的主要性质
• 1.1.5 纤维素酶（系）的作用机制
• 1.2 产纤维素酶的微生物
• 1.3 纤维素酶基因的克隆及表达概况
• 1.4 纤维素酶的应用
• 1.4.1 纤维素酶在食品工业中的应用
• 1.4.2 纤维素酶在饲料工业中的应用
• 1.4.3 纤维素酶在医药中的应用
• 1.4.4 纤维素酶在其它方面的应用
• 1.5 本研究的目的和意义
• 1.6 本研究的主要内容
• 1.7 目前纤维素酶研究的热点及存在的主要问题
• 第二章 绿色木霉纤维素酶（CBHⅡ）基因克隆和序列分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器设备
• 2.2.3 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 两种RNA提取方法完整性与纯度分析
• 2.3.2 RT-PCR体外扩增CBHⅡ基因分析
• 第三章 绿色木霉纤维素酶（CBHⅡ）基因的同源转化及表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器设备
• 3.2.3 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 重组质粒载体pUT-CBH的构建及鉴定
• 3.3.2 重组表达质粒pUT-CE的构建及鉴定
• 3.3.3 重组表达质粒pUT-CE的转化及鉴定
• 3.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 3.3.5 重组工程菌的筛选分析
• 3.3.6 重组工程菌培养条件的分析
• 3.3.7 重组工程菌酶活力及遗传稳定性的分析
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介