儿童支原体肺炎的P1蛋白基因分型及支气管镜特点

论文摘要

目的：观察2010年11月-2011年5月在天津市儿童医院住院的支原体肺炎（MPP）患儿,该组均行纤维支气管镜检并获得支气管灌洗液（BALF）,提取目的DNA片段,经Nested-PCR快速诊断MP感染,再通过PCR-RFLP的方法对MP-P1基因分型,探讨MPP的P1黏附蛋白基因分型的表达及临床支气管镜检特点。方法：观察2010年11月-2011年5月在天津市儿童医院住院患儿符合MPP 46例,临床分为两组：普通型支原体肺炎（MPPG）和难治型支原体肺炎（RMPP）。本组均经纤维支气管镜检查并获得支气管灌洗液（BALF）。以细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA,设计针对MP的ADH3/ADH4的引物,以Nested-PCR技术扩增MP目的DNA片段。再以HaeⅢ限制性内切酶,HapⅡ限制性内切酶,采用（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）限制性片段长度多态性分析PCR-RELP方法,对MP进行P1基因的分型。并测定部分MP-P1基因的核苷酸序列。将所测标本的核苷酸序列在Genebank中用BLAST与标准株M129的Pl基因比较,确定同源性。观察两组MPP的患儿行纤维支气管镜检的特点、进行分析及灌洗治疗。支气管狭窄明显的两例患儿行支气管镜下活检及病理。结果：1.对临床符合MPP诊断46例,提取支气管灌洗液（BALF）行Nested-PCR检测,Nested-PCR阳性20例,阳性率为43.4%。2.本组RMPP21例,Nested-PCR阳性12例；MPPG 25例中,阳性8例。（χ2=2.936,p=0.087）,p>0.05两组无统计学差异。3.采用限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）方法,对20例阳性标本MP的基因分型,均符合MP的P1基因I型。PCR检测的阳性标本部分核苷酸测序,将所测标本的核苷酸序列在Genebank中用BLAST与标准株M129的P1基因（序列号为M18639）比较,其同源性为99%。4. MPP 46例,年龄11月-13岁,平均（6.61±2.76）岁,6-9岁为20例（43.4%）。胸部X线表现为大叶肺实变（69.6%）,肺门周围炎（21.7%）,肺门周围及支气管周围均质或不均质阴影（17.4%）,全肺野的弥漫性阴影（13%）,胸腔积液（17.4%）肺不张（6.5%）。螺旋CT示：斑片状或大片阴影（60.9%）,肺门或纵隔淋巴结肿大（21.7%）。5.支气管镜检改变：46例患儿行纤维支气管镜检,所有病例均见病变部位支气管黏膜充血水肿,可见黏性分泌物附着,支气管镜检下直视的病变部位与胸部X线及CT相符。主要表现为段支气管通气不畅（60.9%）,叶或段支气管开口肿胀狭窄（26.1%）,黏液栓致开口栓塞（13%）,息肉样新生物致开口闭塞（10.9%）,纵行皱褶（21.7%）,管壁血管显露、走行粗重（13%）,管壁黏膜小结节样突起（8.7%）,腔脓性分泌物（10.9%）。其中,2例患儿因病情迁延,支气管镜直视下均发现支气管开口明显狭窄,行纤维支气管镜下活检并送病理检查,结果显示：光镜下显示支气管粘膜炎性改变。可见支气管粘膜炎性渗出,中性粒细胞浸润,另一患儿光镜下表现为支气管粘膜上皮增生,急慢性炎细胞浸润即大量的淋巴细胞及中性粒细胞浸润。结论：1、本研究通过对46例MPP患儿的BALF进行检测,46例患儿,Nested-PCR阳性为20例（43.4%）。Nested-PCR对MP感染具有快速诊断,阳性率可靠,特异性高,它可以作为临床MP感染早期诊断的金指标。2、本研究发现PCR-RFLP方法确定本组MPP病例为MP的P1-Ⅰ型。PCR-RFLP方法能够成功的将MP进行分型,确定MP流行区域的基因类型。3、本组MPP约占CAP的17.9%。6岁以上儿童为MP感染高发组。4、纤维支气管镜术有助于RMPP的诊断治疗及病情评估,肺泡灌洗治疗方法可以迅速改善儿童RMPP的临床症状,是MPP有效的治疗方法。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 对象和方法
• 1.1 研究对象
• 1.1.1 病例选择
• 1.1.2 临床分组
• 1.1.3 实验室检查
• 1.1.4 胸部X线及CT
• 1.2 标本采集
• 1.3 实验材料
• 1.3.1 主要仪器设备
• 1.3.2 材料与试剂
• 1.3.3 引物筛选
• 1.4 实验步骤
• 1.4.1 DNA提取
• 1.4.2 反应体系和反应条件
• 1.4.3 电泳
• 1.4.4 酶切
• 1.4.5 电泳和结果判读
• 1.4.6 测序与比对
• 1.5 统计学分析
• 结果
• 2.1 MP检测结果
• 2.2 纤维支气管镜提取肺泡洗液的PCR检测
• 2.3 MPP1基因分型
• 2.4 基因测序
• 2.5 MPP的临床研究
• 2.5.1 临床资料
• 2.5.2. 影像学改变
• 2.5.3 纤维支气管镜术
• 2.5.4 RMPP的治疗
• 讨论
• 3.1 应用PCR临床快速诊断临床支原体感染
• 3.2 MP病人的P1的基因型
• 3.3 MPP临床特点
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 肺炎支原体P1基因分析及P1蛋白的研究现状
• 综述参考文献
• 致谢