论文摘要
涎腺腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma, ACC）具有嗜神经侵袭（perineural invasion, PNI）的特性,常侵袭神经并沿神经生长向远处转移。已有一些研究报道了某些基因在ACC发生PNI过程中可能的作用,但大多研究手段比较局限,未能较全面地了解ACC发生PNI的分子机理。而ACC侵袭神经是涉及多基因、多环节、多途径的复杂过程,因此,研究ACC嗜神经侵袭现象时,明确其嗜神经侵袭相关基因表达谱对ACC基础理论的丰富及指导临床治疗均具有重要意义。研究目的:1、利用激光俘获显微切割技术获得侵袭神经的纯一ACC肿瘤细胞群,进而通过基因表达谱芯片技术构建出ACC嗜神经侵袭相关基因表达谱,以辨别潜在的ACC嗜神经侵袭相关标记物。2、从获得的基因表达谱中,选定靶基因CD146（MCAM）,利用RNAi技术高效特异地沉默其表达,分析其对ACC-M细胞的生物学影响及其在抑制ACC-M细胞体外嗜神经侵袭能力中的具体作用。研究方法:1、结合连续冰冻切片H&E染色及免疫组织化学（IHC）方法,从原发ACC肿瘤标本中,判定存在明确PNI现象的ACC标本。利用激光俘获显微切割技术获得侵袭神经的纯一ACC肿瘤细胞群,进而结合RNA线性扩增和基因表达谱芯片技术构建出ACC嗜神经侵袭相关基因表达谱。2、采用实时定量PCR（QRT-PCR）及IHC方法对部分差异表达基因进行验证,以确定基因表达谱芯片筛选结果的可靠性。采用生物信息学方法对获得的ACC嗜神经侵袭相关基因表达谱进行分析,选定靶基因CD146用于下一步的RNA干涉研究。3、利用DNA重组技术将针对CD146及GAPDH基因的不同部位所设计的4对dsDNA序列（包括2对CD146的特异性干扰序列、1对CD146的阴性对照干扰序列和1对GAPDH的阳性对照干扰序列）克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,限制性酶切和基因测序鉴定,构建CD146的shRNA真核表达载体系统。转染ACC-M细胞,结合有限稀释法及G418压力筛选,构建CD146 shRNA真核表达载体稳定转染细胞株,检测RNA干涉后CD146在mRNA及蛋白水平的表达情况。4、检测CD146基因沉默对ACC-M细胞其生物学特性的影响,包括MTT法测定细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期的变化。体外实验应用改良Transwell细胞侵袭实验,以了解CD146基因沉默后ACC-M细胞体外嗜神经侵袭能力的变化。主要实验结果:1、15例原发ACC标本中,6例可判定为存在明确的PNI现象。从6例判定为PNI的肿瘤组织中,激光俘获紧贴神经束且侵袭至神经内膜或神经束膜间的纯一肿瘤细胞群作为嗜神经侵袭组（PNI组）;从该6例肿瘤组织中,同样激光俘获未侵袭神经的纯一肿瘤细胞群作为非嗜神经侵袭组（non-PNI组）,从而获得侵袭神经的纯一ACC肿瘤细胞群。RNA线性扩增结合人类全基因组芯片Agilent human 1A cDNA microarray,检测差异表达基因。在18,716个基因和1,457个ESTs中,所有的6例芯片共同差异表达的基因有53个,这53个基因能够区分出PNI组及non-PNI组肿瘤细胞,其中38个基因表达上调,15个基因表达下调,从而构建出ACC嗜神经侵袭相关基因表达谱。2、53个差异表达基因中,我们使用QRT-PCR及IHC方法验证了其中7个及1个基因,其表达情况均与芯片筛选结果一致。聚类分析显示53个差异表达基因可聚类为5簇,这5簇聚类可详细描述ACC嗜神经侵袭相关基因表达谱。基因功能分析显示在PNI肿瘤细胞组中特异性高表达的基因,其功能与发育、信号转导、神经发生、癌基因、炎性应答、免疫反应、DNA结合、细胞黏附和细胞外基质相关。部分前期ACC芯片研究中表达增高的基因被我们的实验结果所证实,同时我们也获得了一些之前未被证实的在ACC嗜神经侵袭病理过程中可能起重要作用的新基因。3、以CD146为靶基因,成功构建了CD146 shRNA真核表达载体系统,包括特异性干扰载体pGe-CD146-shRNA1, 2 ;阴性干扰载体pGe-negative-shRNA以及阳性干扰载体pGe-GAPDH-shRNA。结合有限稀释法及G418压力筛选,我们构建了CD146 shRNA真核表达载体稳定转染细胞株,证实稳定转染细胞中,CD146在mRNA及其蛋白的表达水平被显著抑制。4、MTT及流式细胞仪研究结果表明,CD146基因沉默可能通过阻碍ACC-M细胞从G0/G1期进入S期,抑制DNA合成,从而抑制细胞增殖。改良Transwell细胞侵袭实验证实CD146基因沉默可抑制ACC-M细胞体外嗜神经侵袭能力;根据不同位点设计的CD146 shRNA可能导致抑制ACC-M细胞体外嗜神经侵袭能力的差异。结论:1、结合激光俘获显微切割和基因表达谱芯片技术成功构建出ACC嗜神经侵袭相关基因表达谱。聚类分析及基因功能分析可以较全面的分析基因表达谱结果。某些基因在其PNI的病理过程中的作用值得进一步研究。2、CD146 shRNA真核表达载体及其稳定转染细胞株可高效、特异性阻断CD146基因表达,是研究其功能的良好平台。3、CD146基因沉默能够显著抑制ACC-M细胞的恶性表型,尤其可显著抑制其体外嗜神经侵袭能力,提示CD146基因有可能成为ACC嗜神经侵袭相关标志物和治疗的靶基因。
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标签：腺样囊性论文; 嗜神经侵袭论文; 基因芯片论文; 激光俘获显微切割论文; 干扰论文;