论文摘要
低温、干旱和高盐等逆境条件是影响植物生长、发育和地理分布的重要环境限制因素,是制约我国乃至世界农业生产的重大问题。提高作物的抗渗透胁迫能力,对于开发耕地资源、提高粮食产量、节约水资源具有重大的战略意义。因此,改良作物的抗渗透胁迫能力已成为现代农业研究一个亟待解决的重要问题。植物的抗胁迫反应是一个系统的调控过程,需要众多基因和因子的参与,单独导入个别功能基因对植物抗逆性的改良效果十分有限,难以达到实际生产的要求。而一些在信号转导过程中起调节作用的蛋白质因子,尤其是一些蛋白激酶,单基因的高效表达就可以激活很多靶基因的转录和表达,达到多个功能基因的效果。因此,从这些关键的蛋白激酶基因入手,可能是提高作物抗逆性更为有效的方法和途径。然而,目前可利用于分子育种的有效基因资源比较匮乏。因此,获得具有独立知识产权的、对植物渗透胁迫抗性起关键作用的调控基因,是进行作物转基因育种的重要前提。野生大豆具有很强的抗逆性和适应能力,是利用基因工程手段进行作物抗逆分子育种的重要基因来源供体材料。本研究以耐盐东北野生大豆为试材,利用与Affymetrix大豆基因表达分析芯片杂交所得的基因表达谱,预测dbEST数据库中野生大豆所有EST代表的基因在渗透胁迫早期的表达情况,选取了分别在NaCl和4℃胁迫早期（1小时）上调表达的蛋白激酶EST;通过电子克隆、SMART和RACE结合的方法获得了基因编码区的全长序列;利用生物信息学方法初步分析了基因产物的性质、结构和功能;并利用实时荧光定量PCR分析了野生大豆中该基因的表达模式。获得的基因具有自主知识产权;通过后续的研究,可丰富作物抗渗透胁迫分子育种的基因资源,并为抗渗透胁迫机理的研究奠定理论基础。主要研究结果如下:1.野生大豆渗透胁迫早期应答蛋白激酶EST的筛选结合本研究室构建的野生大豆渗透胁迫基因表达谱,利用Linux序列分析平台,预测了NCBI的EST数据库中（dbEST）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html）所有野生大豆EST代表的基因在渗透胁迫早期（1小时）的表达情况,筛选出了在4℃胁迫处理表达量上调的非冗余蛋白激酶EST 18个;在NaCl胁迫处理表达量上调的蛋白激酶EST 20个;在PEG胁迫处理表达量上调的蛋白激酶EST 27个。进一步根据BlastN和BlastX的注释信息,选取了在NaCl胁迫处理表达量上调的GsPK和在4℃胁迫处理表达量上调的GsLRPK进行全长基因的克隆。2.野生大豆渗透胁迫早期应答蛋白激酶基因的克隆利用电子克隆、RACE技术克隆得到了2个全长的蛋白激酶基因:GsPK（ORF区共1020bp,编码399个氨基酸）、GsLRPK（ORF区共2145bp,编码714个氨基酸）。3.目的基因的生物信息学分析利用DNAMAN、Antheprot等分析软件,以及常用的数据库和在线分析工具,对所克隆的GsPK和GsLRPK基因的编码产物进行了物理性质、保守结构域、二级结构、细胞内定位等特征的分析,结果显示:GsPK基因产物的分子量为38483.8D,等电点（PI）为6.84。N端不含有信号肽,C端具有蛋白激酶家族的特征性催化结构域,且含有跨膜结构域。GsLRPK基因产物的分子量为77689.5D,等电点（PI）为5.60。GsLRPK蛋白具有LRR-RLK家族的特征性结构——胞外串联排列的LRR基序、跨膜结构域和胞内蛋白激酶催化结构域。N端的22个氨基酸被预测为信号肽。同时,这两个蛋白都具有潜在的磷酸化位点、糖基化和肉豆蔻酰基化位点,可能受翻译后修饰的调控。