脑缺血后STAT信号转导系统的调控及电针干预作用的研究

论文摘要

脑血管疾病是危害中老年人健康的一类常见病。随着人口的老龄化,脑血管疾病的发病率有逐年增高的趋势,我国属于世界上脑血管疾病高发国家之一。据统计：在我国,每年仍有160万-200万脑缺血卒中新发病例。其中80%有不同程度的功能障碍,50%-70%遗留有轻重不等的认知障碍,约有25%发展成痴呆。每年我国死于缺血性卒中的人数高达75万,占全部中风病死亡率3/4,该病已经成为人类的健康和生存质量的严重威胁。因此寻找有效的治疗手段并阐释其机理仍然是目前脑科学领域的研究热点。本文拟从针刺对脑缺血大鼠STAT信号转导系统的干预调控作用方面进行研究,以进一步揭示针刺治疗缺血性中风的作用机制,为临床治疗提供坚实的理论基础。本文分为文献研究、实验研究及小结三大部分。1.文献研究通过对中风病因病机理论的古代及现代文献研究,中风的病因繁多,病机复杂,发病急骤,变化多端,表现各异。大量的实验研究也揭示了针灸治疗缺血性中风的可能作用机制。现代医学认为缺血性中风主要是由于脑局部循环障碍,引起以智力障碍、躯体运动功能障碍为主要表现的临床常见疾病。缺血区的脑组织可分为严重缺血的无灌流的中心坏死区和位于周边的低灌流的缺血半暗带区（ischemic penumbra, IP）。随着缺血时间的延长,坏死区逐渐扩大,而半暗带区不断缩小。细胞凋亡主要出现在缺血半暗带,凋亡可能决定了最终梗死体积。因此,尽快恢复缺血半暗带的功能,抵制凋亡和抢救受损细胞是治疗脑缺血的关键。细胞凋亡是受细胞内活性基因、酶和信号转导途径调控的一个“瀑布式”过程,是细胞主动死亡的过程。神经细胞是否发生凋亡是许多细胞活性因子共同作用的结果。其中,尤其以JAK （Janus kinase）/STAT （signal transducer and activator of transcription）家族的调控对此起着决定性的作用。目前研究发现：细胞凋亡可能与STAT1、STAT3激活相关,而细胞生存和修复可能与STAT5激活有关。针灸在治疗脑缺血性疾病有独特的疗效。在此基础上,研究针灸干预对脑缺血大鼠模型脑内信号转导系统的影响,探讨病灶区域内信号转导系统即STAT家族各成员及其mRNA表达水平及相关调制因子作用的机制,对进一步了解针灸治疗脑缺血,干预细胞凋亡的内在机制,有一定的参考价值。2.实验研究目的：观察针刺对局灶性脑缺血大鼠缺血灶周围区不同时间段STAT信号转导系统反应性变化的影响,进一步揭示针刺治疗脑缺血疾病的可能作用机制。方法：雄性SD大鼠300只,随机分为5组：假手术组、模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组,各组又分为术后2h,1d,3d,1w及3w 5个时段组,12只/时段组。模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组采用电凝闭大脑中动脉建立局灶性脑缺血（MCAO）模型,假手术组只暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭。电针组和AG490+电针组术后2h立即给予电针治疗,取百会（GV20）、大椎（GV14）穴,选用疏密波,5-10次/s,强度以大鼠安静耐受为度,电压约2-3V,留针30min,1次/d。其他3组不予针刺处理。观察以下指标：（1）参照Zea-Longa的5分制评分标准,对各组大鼠进行神经功能缺损评分。（2）采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法观测局灶性脑缺血模型大鼠在不同时段缺血侧大脑皮质神经细胞凋亡情况以及电针的干预作用。（3）采用免疫荧光、原位杂交及蛋白印迹等技术检测病灶侧皮质STATs （STAT1、STAT3、STAT5）表达的变化以及电针的干预作用。结果：（1）电针对不同时段局灶性脑缺血模型大鼠神经运动功能的影响。不同时段的模型组与假手术组比较均有显著差异,大鼠造模后均出现不同程度的神经缺损体征,表明脑缺血模型造模成功。脑缺血1d时其余各组大鼠经神经功能缺损评分均处于较高水平。模型组的分值最高,分别与电针组、AG490组以及AG490+电针组比较,差异均有显著意义（P<0.01）,而后三组之间的差异没有统计学意义（均P>0.05）。模型3d组大鼠神经功能障碍有所减轻,部分大鼠向病灶对侧倾倒,与假手术组比较仍有显著差异（P<0.01）,而电针组、AG490组和AG490+电针组大鼠神经缺损功能逐渐恢复,评分明显低于模型组（P<0.01）,而三组间的差异仍无统计学意义（均P>0.05）。缺血1w后,各组大鼠神经功能缺损状况有所改善,评分均较3d组降低,而且各组内此两时段之间、以及各自与假手术组之间比较的差异有统计学意义（均P<0.01）。3w后模型组与电针组神经缺损评分继续下降,但与1w组比较无明显差异,与假手术组比较均有显著的差异（P<0.01）,模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组之间无显著差异（P>0.05）。（2）电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区神经细胞凋亡的影响。缺血2h后模型组、电针组、AG490组、AG490+电针组凋亡细胞即开始增多,与同时段假手术组相比均有显著的差异（均P<0.01）,而各组之间无明显差异（均P>0.05）。缺血1d后各组均继续升高,其中以模型组的水平最高,电针组、AG490组和AG490+电针组的明显低于模型组（均P<0.01）,而三组之间的差异均不明显（均P>0.05）。各组在缺血3d后开始下降,而电针组、AG490组与AG490+电针组均远低于同时段的模型组（均P<0.01）,三组均处于较低的水平,组间差异不明显（均P>0.05）。到了缺血后3w各组已接近正常水平,各组间差异不明显（均P>0.05）。（3）电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区STATs表达的影响。①电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区STAT1表达的影响。各时段的假手术组均只有少量STAT1表达。缺血2h后模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组STAT1的含量即开始升高,与同时段假手术组相比均有显著的差异（均P<0.01）,而各组之间无明显差异（均P>0.05）。缺血1d后各组STAT1的表达均继续升高,其中以模型组与AG49组的STAT1表达水平较高,电针组和AG490+电针组的STAT1表达明显低于上述两组,之间的差异均有统计学意义（均P<0.01）。各组在缺血3d后STAT1表达水平开始下降,而电针组与AG490+电针组均低于同时段的模型组和AG490组（均P<0.01）。在缺血1w后各干预组仍可检测到STAT1的表达,到了缺血后3w各组STAT1蛋白已接近正常水平,组间差异不明显（均P>0.05）。②电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区p-STAT3表达的影响。各时段的假手术组均只有极少数量p-STAT3表达。缺血2h后模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组p-STAT3表达水平即开始升高,与同时段假手术组相比均有显著的差异（均P<0.01）,其中又以模型组与电针组升高明显,均明显高于同时段的AG490组、AG490+电针组（均至P<0.01）。而模型组与电针组之间以及AG490组与AG490+电针组之间的差异则不明显（均P>0.05）。缺血1d后各组均升高达到峰值,模型组最为显著,电针组次之,AG490组及AG490+电针组即使达到组内峰值,也处于较低的水平。各组在缺血3d后p-STAT3表达水平开始下降,电针组、AG490组及AG490+电针组均明显低于模型组（均P<0.01）,且三组之间的差异不明显（均P>0.05）,持续下降至缺血1w后,各组p-STAT3含量已接近假手术组水平,组间的差异不明显（均P>0.05）。到了缺血后3w各组p-STAT3含量已恢复正常水平,组间差异不明显（均P>0.05）。③电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区p-STAT5表达的影响。在实验各时段假手术组只检测到少数量的p-STAT5蛋白表达。缺血后2h模型组、电针组、AG490组和AG490+电针组即见有大量p-STAT5的表达,其中模型组和电针组处于较高的表达水平,AG490组及AG490+电针组的表达稍低,但模型组和电针组之间,以及AG490组及AG490+电针组之间均无明显差异（均P>0.05）,且与同时段假手术组相比均有显著的差异（均P<0.01）。缺血1d后各干预组p-STAT5蛋白的表达情况与缺血2h基本相同,而缺血3d后各干预组的p-STAT5水平开始下降,其中电针组的水平较高,模型组次之,AG490组及AG490+电针组的表达水平低于以上两组（均P<0.01）,到了缺血后3w各组p-STAT5表达已接近正常水平,组间差异不明显（均P>0.05）。3结论：综上所述：电针可以提高脑缺血模型大鼠神经功能缺损评分,其对缺血性脑损伤的功能改善内在机制可能与电针对脑缺血病灶区STAT系统调控作用有一定的关系,即抑制STAT1的含量及p-STAT3的表达,提高p-STAT5的表达水平。通过此途径所形成的自身保护、修复机制的启动,达到抑制病灶区半暗带细胞的凋亡,恢复受损的脑组织的细胞功能。初步验证了“针刺刺激--信号调节-自稳态调节启动是其脑缺血局部自我修复的关键作用机制之一”的科学假说,为针灸治疗缺血性脑血管疾病提供了一定的科学依据和理论指导。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献研究
• 一、中医对中风的认识
• 1. 中医中风的命名
• 2. 中医对中风病因病机的认识
• 3. 针刺治疗中风病古代文献研究
• 二、针刺治疗缺血性中风的临床研究进展
• 1. 体针疗法治疗缺血性中风的临床研究进展
• 2. 头针疗法治疗缺血性中风的临床研究进展
• 3. 经筋刺法治疗缺血性中风的临床研究进展
• 4. 透刺疗法治疗缺血性中风的临床研究进展
• 5. 腹针疗法治疗缺血性中风的临床研究进展
• 6. 眼针疗法治疗缺血性中风的临床研究进展
• 7. 其他疗法治疗缺血性中风的临床研究进展
• 三、针刺治疗缺血性中风的作用机理研究
• 1. 改善血液流变性和微循环
• 2. 增加缺血区脑血流量
• 3. 对抗氧自由基损伤
• 4. 减轻兴奋性氨基酸毒性
• 2+超载'>5. 阻止细胞内Ca²⁺超载
• 6. 降低一氧化氮（NO）毒性
• 7. 抑制神经细胞凋亡
• 四、JAK/STAT信号转导系统与脑缺血发病机制的研究现状
• 1. JAKs/STATs信号转导系统概况
• 2. JAKs及STATs成员在中枢神经系统中的表达
• 3. JAKs/STATs信号转导系统在缺血性脑损伤中的作用
• 4. 针刺对脑缺血后JAK/STAT系统的影响
• 第二部分 实验研究
• 实验一 电针对不同时段局灶性脑缺血模型大鼠神经运动功能的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验二 电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区神经细胞凋亡的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验三 电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区STAT1表达的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验四 电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区P-STAT3表达的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验五 电针对不同时段脑缺血模型大鼠缺血灶周围区P-STAT5表达的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 小结
• 1 文献研究
• 1.1 中医学对中风的认识
• 1.2 现代研究进展
• 1.3 结论
• 2 实验研究
• 2.1 动物模型的选择
• 2.2 电针参数的选择
• 2.3 实验取穴依据
• 2.4 研究内容和结果
• 2.5 结论
• 3 本研究的创新之处
• 4 展望
• 参考文献
• 附录
• 英文缩略词表
• 博士研究生期间发表的学术论文
• 致谢