论文摘要
猪苓是一种传统药用真菌，用于抗肿瘤，增强免疫、保肝、利尿等，猪苓多糖是一种免疫调节剂，体内能抑制肿瘤细胞增长而对正常细胞无毒副作用。目前对猪苓多糖的研究主要集中在菌核多糖，对猪苓液体发酵菌丝体多糖和发酵液多糖的研究较少，因此对猪苓液体发酵菌丝体多糖和发酵液多糖的提取、纯化方法及多糖活性进行研究，对保健食品以及药品的研究开发具有重要意义。本研究通过液体发酵培养获得猪苓菌丝体和发酵液，并对猪苓菌丝体、发酵液多糖与野生菌核多糖的化学结构，理化性质以及药理活性等方面进行了分析比较。本研究采用正交实验设计，以温度、料液比、提取时间为因素，考察了水提猪苓多糖的最佳工艺条件，即料液比1∶20，温度100℃，提取时间4h，浸提次数2次。采用热水浸提、乙醇沉淀、Sevage法脱蛋白、活性炭脱色、DEAE分级、Sephadex G-200柱层析等技术方法，从猪苓深层培养菌丝体、浅层培养菌丝体以及菌核中分离纯化得到3个组分，经HPLC，Sephadex G200柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，三者都为均一的水溶性多糖，分别是：CM（深层发酵培养菌丝体多糖单组分）、SM（浅层发酵培养菌丝体多糖单组分）和SC（猪苓菌核多糖单组分），从发酵液中提取出胞外多糖，采用上述同样纯化步骤，得到2种不均一的水溶性多糖组分CFL（深层发酵培养滤液多糖）和SFL（浅层发酵培养滤液多糖）。同时，我们对活性炭脱色技术进行了专利保护。我们应用高效液相色谱（HPLC）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、旋光度测定、纸层析、气相质谱联用（GC-MS）、紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振（NMR）等技术方法分析了多糖的旋光度等理化性质；初步表征了多糖的分子量、构型、单糖组成与摩尔比以及连接方式等一级结构信息。结果表明：从猪苓菌核、深层培养菌丝体和浅层培养菌丝体中分离得到的水提粗多糖，得率分别为：1．42％、6．23％、2．20％；苯酚-硫酸法测得SC、CM、SM、CFL、SFL中总糖含量依次为：60．07％、55．06％、49．72％、37．73％、47．42％。SC、CM、SM分子量分别为：33．251 kDa、32．529 kDa、32．187 kDa；CFL、SFL由于不是均一多糖，故只能测得其所含主要多糖组分的分子量，分别30．185 kDa、33．741 kDa。SC、CM和SM的比旋光度分别为：+79°、+135．25°、+110．5°。SC中甘露糖与葡萄糖摩尔比为3．59∶1．00，残基组成为β-型吡喃糖残基：α-型吡喃糖残基=7∶5．5，可能含有β-1,4-Glc、β-1,6-Glc的主链结构。CM、SM均主要含有甘露糖和半乳糖，只是CM中甘露糖与半乳糖摩尔比为1．00∶42．79，SM中甘露糖与半乳糖摩尔比为1．00∶12．00，CM和SM均为α-1,6-Gal。由此可见，SC和CM、SM的分子量接近，而在单糖组成及比例上有所差异。通过体外促小鼠脾细胞增殖实验和体外抗氧化实验比较了多糖的生物活性差异：体外促小鼠脾淋巴细胞增殖实验表明猪苓菌核粗多糖、脱蛋白后猪苓菌核粗多糖、SC、CM、SM、CFL和SFL均能显著的促进小鼠B淋巴细胞增殖；脱蛋白前后菌核粗多糖和菌核多糖单组分（SC）对增殖率的影响无显著差异，初步说明脱蛋白、脱色素处理没有影响到多糖活性：SC、CM、SM对淋巴细胞增殖率的促进作用差异不显著，CFL和SFL促淋巴细胞增殖作用差异也不显著，但二者均显著弱于SC、CM、SM的促淋巴细胞增殖作用。本研究采用Fenton反应模型产生OH（·），结果表明，SC、CM、SM、CFL、SFL与空白组相比，在浓度为20 mg／mL时，均具有显著清除OH（·）的作用（P<0．01）：SC、CM、SFL清除OH（·）能力无显著性差异（P>0．05），SM、CFL清除OH（·）能力无显著性差异（P>0．05），但均显著弱于SC、CM和SFL清除OH（·）的能力。本研究采用邻苯三酚自氧化模型测定了SC、CM、SM、CFL、SFL清除（?）的能力，在浓度为20 mg／mL时，CM、SM、CFL和SFL清除（?）能力无显著性差异（P>0．05），SC清除（?）能力显著强于CM、SM、CFL和SFL；脱蛋白前后菌核粗多糖和菌核多糖单组分（SC）清除OH（·）和（?）能力差异均不显著，初步推断脱蛋白和脱色步骤对多糖抗氧化活性也无影响。同时，本文还对食药用真菌在保健食品中的开发应用进行了综述。