论文摘要
本试验研究了山羊-绵羊异质体细胞克隆胚（以山羊胎儿成纤维细胞为核供体,以体外培养成熟的绵羊卵母细胞为核受体）的构建过程中促卵泡素（FSH）和发情牛血清（ECS）对绵羊卵母细胞体外成熟的影响以及电融合参数的确定;此外,在异质克隆胚早期发育的不同阶段（1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞和囊胚）,采用PCR-限制性片段长度多态性法（PCR-RFLP）对线粒体DNA的来源及组成比例进行了研究。所得试验结果如下:1. FSH的浓度为0.2 IU/mL时,绵羊卵母细胞的体外成熟率和卵裂率均高于对照组和其他实验组,分别为72.5 %和77.3 %,与对照组（不添加FSH）和其他实验组之间差异显著（ P < 0. 05）,且试验组与对照组之间均存在显著差异（ P < 0. 05）。该结果表明FSH在绵羊卵母细胞体外成熟过程中起着显著的促进作用,且FSH在卵母细胞体外成熟过程中的作用于其浓度成剂量依赖关系。2.在FSH浓度为0.2 IU/mL的基础上,添加10 %的发情第一天（D1）和第三天（D3）ECS时,绵羊卵母细胞的成熟率和卵裂率较高（分别为D1:79.1 %和76.5 %;D3:75.8 %和74.4 % ）,与对照组和发情第五天（D5）、第七天（D7）ECS组相比差异显著（ P < 0. 05）;实验天数范围内,添加5 %的D7的ECS的囊胚率最高,为44.4 %,与对照组和D1差异显著（ P < 0. 05）,但与D3和D5之间差异不显著（ P > 0. 05）。该结果表明,随着发情的发展,ECS在卵母细胞成熟和卵裂方面的促进作用有降低的趋势,而在囊胚形成方面的促进作用有增强的趋势。进一步研究表明,添加ECS浓度为10 %和15 %时,绵羊卵母细胞的成熟率和卵裂率无显著差异（ P > 0. 05）。3.在1次脉冲,脉冲时程20μs的条件下,电场强度为1.2 kv/cm和1.4 kv/cm时,重构胚的融合率、卵裂率及囊胚率之间无显著差异（P>0.05）;电场强度为1.2 kv/cm （58.82 %）和1.4 kv/cm （ 61.36 %）时的融合率虽然显著低于电场强度为1.6 kv/cm（73.68 %）和1.8 kv/cm （ 80.61 %）时（P<0.05）,但其卵裂率（1.2 kv/cm时为68.33 %,1.4 kv/cm时为72.22 %）却显著高于后两者（1.6 kv/cm时为47.14 %,1.8 kv/cm时为31.65 %）（P<0.05）,且囊胚率也略高。因此,对山羊-绵羊重组卵的理想电场强度为1.2 kv/cm 1.4 kv/cm。4.电脉冲强度为1.4 kv/cm,脉冲时程为20μs/次时,2次电脉冲（间隔1 s）的融合率和卵裂率均高于1次和3次电脉冲（间隔1 s）,且其囊胚发育率也略高,表明试验范围内2次电脉冲的效果较好。融合后将重构胚在成熟液中平衡60120 min都有利于卵裂,平衡90 min时,囊胚发育率可达到17.72 %。5.采用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-restriction fragment length polymer -phism, PCR-RFLP）的方法分析以山羊（Capra hircus）胎儿成纤维细胞为核供体,以去核的绵羊（Ovis aries L）MⅡ期卵母细胞为核受体构建的异质克隆胚中线粒体的来源及组成比例。结果表明,8-细胞之前的异质克隆胚中供受体mtDNA的比例变化不大,1-细胞、2-细胞、4-细胞和8-细胞异质克隆胚中核供体细胞mtDNA占受体细胞mtDNA的比例分别为（2.5±0.8）%、（2.8±0.6）%、（1.9±0.4）%和（1.7±0.6）%,彼此之间差异不显著（P>0.05）;但异质克隆囊胚中核供体细胞mtDNA的比例下降为（0.3±0.1）%,与前四者相比差异显著（P<0.05）。据此,我们提出了一种核供体来源的线粒体选择性降解的机制,即由于核供体来源的线粒体生物学功能受到抑制,从而导致其退化并被选择性地降解。