论文摘要
目前,肺癌的发病率和死亡率在世界范围内均居癌症之首。20世纪90年代与70年代相比,我国肺癌的死亡率上升了111.85%。肺癌的治疗仍以手术切除为主,辅以化疗和放疗,但转移和死亡率仍居高不下,这也是肺癌治疗失败的原因,因此,研究新的肺癌治疗方法显得非常必要。随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的不断发展,以免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗受到了人们的高度重视,已经成为继手术、化疗和放疗以后的第四种肿瘤治疗模式,它主要通过调动或增强机体内部固有的抗肿瘤能力来抑制肿瘤生长,可以避免当前肿瘤治疗模式的严重不足之处,展示了良好的临床应用前景。肺癌的靶向治疗是生物治疗的一种模式,目前已有研制成功和上市的肺癌的靶向治疗药物,大多是一些单克隆抗体制剂,包括Iressa、Tarceva、Veenat、Sutent和Sorafenib Nexavar等,基本上也都是靶向肿瘤血管上的特异性蛋白分子。虽然这些药物在一定程度上抑制了肺癌的生长,延长了患者的生存期。但是大量的循证医学研究证实,它们的疗效不尽人意。长期使用单克隆抗体还会出现严重的不良反应,并且价格昂贵,这些都限制了它们的临床使用。以肿瘤血管内皮细胞为靶点的主动免疫治疗维持的时间较长,无需频繁的反复给药;且特异性的体液免疫反应或细胞免疫反应副作用较小,所以诱导抗肿瘤血管的主动免疫效应是一种更有效的治疗方法。肿瘤血管内皮细胞处于活跃增殖状态,其细胞膜上表达多种与细胞增殖相关的特异性蛋白分子,是血管内皮细胞增殖相关抗原,如血管内皮细胞生长因子受体Ⅱ（Vascular Endothelial GrowthFactor Receptor,VEGFR-Ⅱ）、整合素av（CD51）、组织因子、Endoglin（CD105）等,这些蛋白分子在体内静止期的血管内皮细胞上却不表达。研究表明,利用体外培养的增殖活跃的异种血管内皮细胞制备疫苗,可以成功打破免疫耐受,诱导抗肿瘤血管生成。近来,用异种血管内皮细胞增殖相关蛋白和DNA分子疫苗相关研究较多,以同种蛋白和DNA分子疫苗也有报道,但由于引起的超敏反应、单一靶点的治疗效果的局限性,备受争议,寻找多靶点治疗且副作用少的主动免疫治疗方法势在必行。本研究对来源于微血管的小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3进行体外培养,制备疫苗,免疫小鼠并观察其对肺癌皮下移植瘤、肺转移癌的抗肿瘤效应。另一方面,本研究应用小鼠bEnd.3制备抗原,冲击树突状细胞（Dendritic Cells,DCs）,观察其诱导的体内外特异性抗肿瘤血管生成的免疫反应,并初步探索其机制,试图寻找一种新的抗肿瘤血管治疗方法。人脐静脉血管内皮细胞（Human UmbilicalVein Endothelial Cells,HUVEC）来源于大的静脉血管,多项研究报道异种HUVEC有抗肿瘤血管生成的作用,因此,本研究用异种HUVEC和同种小鼠成纤维细胞（NIH3T3）作对照,来观察不同来源的两个血管内皮细胞的抗肿瘤血管生成作用。第一部分同种bEnd.3细胞疫苗诱导小鼠抗肺癌血管内皮细胞的免疫效应第一章同种bEnd.3细胞的培养及疫苗制备方法:1.体外常规培养小鼠bEnd.3细胞,从人脐带分离培养HUVEC,体外扩增,通过细胞表面标志vWF、CD31和CD144的细胞免疫组化和RT-PCR方法鉴定两种细胞。2.利用RT-PCR方法检测血管内皮细胞增殖相关抗原VEGFR-Ⅱ和整合素av基因在bEnd.3、HUVEC、NIH3T3、肿瘤细胞LLCs和U14的表达。3.bEnd.3、HUVEC、NIH3T3细胞在体外大量扩增后,用0.025%戊二醛固定制备疫苗,疫苗浓度2.5×107/ml。结果:1.成功培养和体外大量扩增了小鼠bEnd.3细胞和人HUVEC细胞,它们均分别高表达vWF、CD31和vWF、CD144等血管内皮细胞标志。2.在mRNA水平,bEnd.3细胞和HUVEC细胞同时表达VEGFR-Ⅱ和整合素av基因,NIH3T3细胞不表达VEGFR-Ⅱ和整合素av基因,肿瘤细胞LLCs和U14均只表达整合素av,不表达VEGFR-Ⅱ。3.用0.025%戊二醛成功制备疫苗。第二章同种bEnd.3疫苗诱导小鼠对Lewis肺癌皮下移植瘤免疫效应检测方法:1.小鼠分预防组和治疗组,治疗组又分为血清治疗组和T淋巴细胞治疗组,疫苗分bEnd.3组、HUVEC组、NIH3T3组和PBS组。预防组直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,5×106个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞。治疗组用ELISA检测阳性的免疫小鼠的抗血清和脾T淋巴细胞进行治疗,血清治疗组,在荷瘤一周后,肌肉注射50μl/只,隔日注射一次,共6次。T淋巴细胞组,在荷瘤一周后,肿瘤周围注射1×107个脾T细胞,隔日注射一次,共6次。2.观察小鼠肿瘤体积,小鼠生存期;HE染色观察瘤体组织变化。CCK法和流式细胞术对免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性的检测。ELISA法、免疫细胞化学法和Western blot法对免疫小鼠抗血清的特异性反应检测。3.不良反应检测在免疫后2周的小鼠腹壁上划“十”字伤口,观察其伤口愈合情况。结果:1.抑制了小鼠肺癌皮下移植瘤的生长和延长了生存期在小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤预防组中,bEnd.3组小鼠肿瘤生长速度缓慢,而且在生长3周肿瘤体积明显减小约20mm3,之后处于相对停滞状态,与对照组有统计学差异（P＜0.05）。中位生存时间bEnd.3组为90天（终止实验）,较对照组明显延长（P＜0.01）。瘤体剥离后HE染色发现,bEnd.3组为脂肪和肌肉组织,无癌细胞,而NIH3T3和PBS组均是癌细胞。T细胞治疗组和血清治疗组中,bEnd.3组小鼠肿瘤生长速度减慢,生存时间较NIH3T3和PBS组长（P＜0.05）。但T细胞治疗组较血清治疗组更能延长小鼠生存时间（P＜0.05）。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤活性流式细胞术检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组CD3+CD8+的T细胞百分比高于对照组（P＜0.05）,CCK法检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组在效:靶为25:1时脾T淋巴细胞具有较强的杀伤体外增殖的bEnd.3细胞和HUVEC细胞的CTLs杀伤活性（P＜0.05）,而对LLCs肺癌细胞却没有杀伤活性。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA结果提示细胞免疫组化结果提示bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组抗血清与体外bEnd.3和HUVEC膜蛋白和细胞有特异性免疫反应,并能对体外增殖的bEnd.3细胞和HUVEC细胞起到抑制作用;Western blot检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组抗血清在220 KD和180 KD处均出现了特异性条带,而HUVEC组在130 KD处有特异性条带,bEnd.3组在130 KD处无特异性条带,两组抗血清与LLCs膜蛋白无特异性反应及条带。4.延迟了伤口愈合bEnd.3组和HUVEC组免疫小鼠的伤口愈合时间较NIH3T3组和PBS组长（P＜0.05）,但均能完全愈合。第三章同种bEnd.3疫苗诱导小鼠对宫颈癌U14肺转移癌的免疫效应检测方法:1.小鼠分预防组和治疗组,疫苗分bEnd.3组、HUVEC组、NIH3T3组和PBS组。预防组直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,5×106个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,尾静脉注射小鼠U14细胞5×106个细胞/只。治疗组先尾静脉注射小鼠U14细胞5×106个细胞/只,然后用疫苗治疗小鼠,于第1,3,5,7,9和11天在小鼠腋窝淋巴结周围皮下注射,共6次。2.观察计算小鼠肺表面转移癌结节数;小鼠生存期;HE染色观察转移癌组织变化;CFSE和PI法检测免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性;流式细胞术检测CD3+CD8+细胞百分比;ELISA法、免疫细胞化学法和Western blot检测抗血清的特异性反应。结果:1.抑制了小鼠宫颈癌U14肺转移癌的转移和延长了生存期bEnd.3组和HUVEC组左肺癌结节数明显少于NIH3T3组和PBS组（P＜0.05）,以预防组更明显;bEnd.3组中位生存时间,预防组可达34天,治疗组26天,而对照组只有19天,预防组生存时间明显延长（P＜0.05）。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤活性流式细胞术检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组CD3+CD8+的T细胞百分比高于对照组（P＜0.05）,CFSE和PI法检测bEnd.3组免疫小鼠脾T淋巴细胞具有杀伤体外增殖的bEnd.3细胞CTLs杀伤活性,HUVEC组也有一致的结果;对U14细胞却没有杀伤活性。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA和细胞免疫组化结果提示bEnd.3组和HUVEC组抗血清与体外bEnd.3和HUVEC膜蛋白和细胞有特异性免疫反应,并能对其体外增殖起到抑制作用;U14小鼠抗血清与bEnd.3膜蛋白有特异性反应发生,Western blot检测bEnd.3抗血清在220 KD和180 KD处出现了特异性条带,在130 KD处无特异性条带,在HUVEC组在220 KD和130 KD处均有特异性条带,在180KD处却无特异性条带;二者与U14膜蛋白无特异性条带产生。第二部分同种bEnd.3细胞抗原致敏DCs诱导小鼠对肺癌血管内皮细胞的免疫效应第一章小鼠bEnd.3抗原制备和小鼠骨髓源DCs培养及鉴定方法:1.收集bEnd.3细胞,反复冻融4次制备抗原。2.体外培养小鼠骨髓来源的DCs,并进行形态学和细胞表面CD11a和CD86表达鉴定。3.抗原以100μg/ml浓度负载DCs。结果:1.根据台盼蓝染色检测细胞冻融效果好,抗原定量检测结果显示1×107个细胞能够收获398.98±96.36μg抗原。2.成功培养小鼠骨髓来源的DCs,经鉴定培养至第8天成为成熟DCs。第二章负载bEnd.3抗原的DCs对体外增殖的血管内皮细胞的影响方法:1.分别负载bEnd.3、HUVEC和NIH3T3抗原的DCs培养8天成熟后,与小鼠脾T淋巴细胞混合培养3天,诱导CTLs,CCK法观察T淋巴细胞体外增殖情况。2.将CTLs与靶细胞bEnd.3、HUVEC和LLCs混合培养3天,MTT法观察其体外杀伤作用。结果:1.体外促进了小鼠脾T淋巴细胞的增殖CCK法检测负载bEnd.3抗原和HUVEC抗原的DCs在体外能够促进小鼠脾T淋巴细胞的增殖,负载NIH3T3抗原的DCs也可促进小鼠脾T淋巴细胞的增殖（P＜0.05）。2.体外诱导了内皮细胞特异的CTLs杀伤活性MTT法负载bEnd.3抗原和HUVEC抗原的DCs有明显杀伤bEnd.3细胞和HUVEC细胞的作用（P＜0.05）,负载NIH3T3抗原的DCs体外诱导的CTLs对bEnd.3细胞和HUVEC细胞无明显杀伤作用。第三章bEnd.3抗原负载的DCs疫苗诱导小鼠对Lewis肺癌皮下移植瘤免疫效应检测方法:1.负载bEnd.3抗原的DCs培养第8天成熟后,收集制备疫苗。疫苗分为bEnd.3DCs组、HUVECDCs组、NIH3T3DCs组、DCs组和PBS组。直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,1×106个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞。2.观察小鼠瘤体增长速度和生存期;检测免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性和免疫小鼠抗血清的特异性反应。结果:1.抑制了小鼠肺癌皮下移植瘤的生长和延长了生存期负载bEnd.3抗原的DCs培养8天成熟后,制备疫苗,免疫小鼠后,bEnd.3DCs组小鼠肿瘤生长速度缓慢,与NIH3T3DCs组和DCs组比较有统计学差异（P＜0.05）。而NIH3T3DCs组和DCs组肿瘤生长速度又比PBS组慢（P＜0.05）。中位生存时间bEnd.3DCs组为65天,NIH3T3DCs组和DCs组分别为55和57天,较对照组明显延长（P＜0.05）。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤CCK法检测bEnd.3DCs组免疫小鼠脾T淋巴细胞具有杀伤体外增殖的bEnd.3细胞CTLs杀伤活性,流式细胞检测结果提示bEnd.3DCs组CD3+CD8+的T细胞百分比高于对照组（P＜0.05）。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA检测荷瘤前后免疫抗血清特异性结果示,荷瘤前后bEnd.3DCs抗血清与bEnd.3的免疫效应无明显差异（P＞0.05）,而荷瘤后的小鼠抗血清中,除PBS组,均能与bEnd.3和LLCs膜蛋白发生反应。Western blot检测bEnd.3DCs组抗血清在220 KD和180 KD处也出现了特异性条带,在130 KD处无特异性条带,HUVECDCs组在220 KD、180 KD和130 KD处均有特异性条带,与LLCs膜蛋白无特异性反应及条带。结论1.同种小鼠bEnd.3细胞疫苗和负载小鼠bEnd.3抗原的DCs疫苗可抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤和小鼠宫颈癌U14肺转移癌的生长和转移,延长了小鼠生存期,预防组抑瘤效果优于治疗组。2.抑瘤效应机制是在体内诱导形成靶向增殖血管内皮细胞的CTLs,诱导产生了抗VEGFR-Ⅱ抗体、抗Endoglin抗体和抗整合素av抗体等血管内皮细胞增殖相关抗体,诱导了抗肿瘤血管的细胞和体液免疫反应,抑制肿瘤的生长。3.内皮细胞疫苗能延长伤口愈合时间,但不影响其最终愈合。4.同种bEnd.3疫苗和异种HUVEC疫苗均能诱导抗肿瘤血管的主动免疫反应,二者抑瘤作用无明显差异。5.bEnd.3的两种疫苗形式之间的抑瘤作用有差异,整个血管内皮细胞疫苗较负载血管内皮细胞抗原的DCs疫苗似乎更有优势。
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- [29].山东非法疫苗案:疫苗监管新政出台[J]. 中国卫生 2016(12)
- [30].山东济南非法经营疫苗系列案件解析及启示[J]. 沈阳药科大学学报 2017(02)