猪瘟病毒E2基因在PK-15细胞中的表达及本体动物的免疫研究

论文摘要

猪瘟（Classical Swine Fever, CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的猪的急性高度接触性传染病,是严重威胁养猪业,具有重要经济意义的病毒性疾病之一。猪瘟病毒可引起猪小血管和毛细血管内皮细胞发生变性、坏死,表现为全身组织器官弥漫性出血。猪瘟病毒为黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的成员,基因组大小约12.3kb,含一个大的开放阅读框（ORF）,由11个编码结构蛋白与非结构蛋白的基因组成。猪瘟病毒E2基因编码的gp55蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原,是研制猪瘟基因工程疫苗的首选基因。采用来源于猪的PK–15细胞做为表达系统,一方面可利用猪细胞对猪瘟病毒遗传密码子的嗜好性,提高E2蛋白的表达量,另一方面猪源细胞表达的E2蛋白的加工与其他表达系统相比有无比的优越性,其免疫原性和疫苗的免疫保护力可望得到很大提高,为猪瘟病毒基因工程疫苗投入实际应用奠定基础。本研究由三部分构成,第一部分是采用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nPCR）克隆出猪瘟病毒石门株的E2基因,并对其核苷酸序列及氨基酸序列的同源性进行比较及分析,绘制系统关系发生树,以期了解猪瘟病毒石门株经多次传代后E2基因的遗传变异情况,为用其研制猪瘟基因工程疫苗提供毒株分子生物学方面的资料。第二部分是用逆转录病毒载体将猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因整合到PK-15细胞基因组中,在PK-15细胞的细胞膜上表达猪瘟病毒E2基因囊膜蛋白。第三部分用表达囊膜蛋白的PK-15细胞免疫Balb/c小鼠和猪,检测抗体水平,并对免疫接种猪进行攻毒试验,为猪瘟基因工程疫苗的应用奠定基础。1.采用RT-PCR和nPCR扩增出猪瘟病毒石门株E2基因,将其分别克隆于pGEM-T Easy载体并进行核苷酸序列测定,进行了核苷酸及氨基酸序列同源性比较,绘制了系统关系树。结果表明,所测CSFV石门株E2基因的长度为1170 bp,编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和部分跨膜序列,共由384个氨基酸组成。将石门株与C株疫苗毒E2基因的核苷酸和所推导的氨基酸序列进行比较,表明其核苷酸序列同源性为94.5%,所推导的氨基酸序列同源性为93. 8%,说明石门株与C株疫苗毒之间存在一定的差异。2.将猪瘟病毒石门株E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染,将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术（FACS）分析和免疫荧光染色鉴定,结果表明猪瘟病毒E2基因在PK-15细胞膜上成功表达。3.将表达E2蛋白的PK-15细胞作为基因工程细胞苗腹腔免疫Balb/c小鼠,经FACS

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 猪瘟及猪瘟病毒的研究进展
• 1.1 猪瘟的研究进展
• 1.1.1 猪瘟概述
• 1.1.2 猪瘟的流行和分布
• 1.1.3 猪瘟的临床症状和致病机理
• 1.1.4 猪瘟的检测
• 1.1.5 猪瘟的防控
• 1.1.6 猪瘟的传统疫苗
• 1.2 猪瘟病毒的病原学特征及研究进展
• 1.2.1 猪瘟病毒的形态及理化特性
• 1.2.2 猪瘟病毒的基因组结构及研究进展
• 1.2.3 猪瘟病毒的侵入及复制
• 1.2.4 猪瘟病毒的编码蛋白及其功能
• 1.2.5 猪瘟病毒的抗原性
• 1.2.6 猪瘟病毒的进化和遗传分型
• 1.3 猪瘟病毒的增殖及细胞培养
• 1.3.1 猪瘟病毒的入侵及增殖
• 1.3.2 猪瘟病毒对宿主细胞的致病机理
• 1.3.3 猪瘟病毒的细胞培养
• 第二章 猪瘟病毒免疫的细胞学研究进展
• 2.1 CSFV 与宿主细胞的相互关系
• 2.2 CSFV 的免疫反应机制
• 2.2.1 抗体在抗 CSFV 感染中的作用
• 2.2.2 抗 CSFV 的细胞免疫
• 2.3 CSFV 的分子生物学及其免疫学性质
• 第三章 新型猪瘟疫苗的研究和应用前景
• 3.1 CSFV 基因缺失型弱毒疫苗
• 3.2 CSFV 亚单位疫苗
• 3.3 CSFV 活载体重组疫苗
• 3.4 CSFV DNA 疫苗
• 3.5 CSFV 全长感染性cDNA 标记疫苗
• 第四章 猪瘟病毒石门株 E2 基因的克隆与序列分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 毒株
• 4.1.2 引物的设计与合成
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 RNA 提取
• 4.2.2 RT-PCR 和nPCR
• 4.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 4.2.4 纯化回收 DNA 片段
• 4.2.5 纯化产物与pGEM-T Easy 连接
• 4.2.6 新鲜感受态细胞的制备（CaCl2 法）
• 4.2.7 连接产物的转化
• 4.2.8 重组质粒的提取
• 4.2.9 重组质粒的鉴定
• 4.2.10 计算机分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 PCR 扩增结果
• 4.3.2 质粒 PCR 及酶切鉴定结果
• 4.3.3 石门株 E2 基因的核苷酸和相应的氨基酸序列
• 4.3.4 核苷酸和氨基酸序列同源性比较
• 4.3.5 石门株与其他猪瘟毒株的系统关系分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 石门株 CSFV E2 基因核苷酸序列及氨基酸序列的同源性
• 4.4.2 3 株 CSFV E2 糖蛋白抗原区氨基酸的变异
• 4.4.3 石门株 CSFV E2 糖蛋白的信号肽序列的分析
• 4.5 小结
• 第五章 逆转录病毒载体介导的猪瘟石门株E2 基因在PK-15 细胞中的表达及动物免疫试验
• 5.1 材料
• 5.1.1 主要试剂
• 5.1.2 细胞系
• 5.1.3 实验动物
• 5.1.4 质粒
• 5.1.5 载体和菌株
• 5.1.6 培养基
• 5.1.7 主要仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 逆转录病毒表达质粒的构建
• 5.2.2 逆转录病毒假病毒制备
• 5.2.3 逆转录病毒假病毒侵染 PK-15 细胞及抗性筛选表达细胞
• 5.2.4 FACS 分析筛选膜表面表达 E2 蛋白的 PK-15 细胞
• 5.2.5 阳性细胞克隆的荧光染色鉴定
• 5.2.6 表达 E2 囊膜蛋白的 PK-15 细胞免疫 Balb/c 小鼠
• 5.2.7 小鼠采血及血清分离
• 5.2.8 小鼠血清抗体的检测
• 5.2.9 表达猪瘟病毒石门株 E2 蛋白的 PK-15 细胞免疫猪
• 5.2.10 免疫猪血清抗体的检测及比较
• 5.2.11 动物攻毒试验
• 5.3 结果
• 5.3.1 重组质粒的 PCR 鉴定结果
• 5.3.2 重组质粒的酶切鉴定结果
• 5.3.3 猪瘟病毒石门株 E2 基因的核苷酸和相应的氨基酸序列
• 5.3.4 嘌呤霉素筛选假病毒感染的 PK-15 细胞
• 5.3.5 FACS 分析检测表达 E2 囊膜蛋白的 PK-15 细胞
• 5.3.6 阳性细胞克隆的荧光染色鉴定
• 5.3.7 免疫小鼠血清抗体的 ELISA 检测
• 5.3.8 免疫猪血清抗体的 ELISA 检测
• 5.3.9 动物攻毒试验结果
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介