一、纤维堆囊菌So9733-1木聚糖酶XynB结构域功能研究 二、四种人源肝脏蛋白的异源表达、纯化和结晶

论文摘要

本研究分为两大内容:一、纤维堆囊菌So9733-1木聚糖酶XynB结构域功能研究;二、四种人源肝脏蛋白的异源表达纯化和晶体生长。重点是XynB结构域功能研究。一、纤维堆囊菌So9733-1木聚糖酶XynB结构域功能研究纤维堆囊菌不但可以产生多种有活性的次级代谢产物,而且还可以有效降解纤维素,但目前关于其纤维素降解机制还未有报道。在本实验室的前期研究中,已经克隆获得了编码纤维堆囊菌So9733-1木聚糖酶XynB的完整基因。该基因全长1197bp,编码398个氨基酸的多肽链。研究表明,该酶为内切木聚糖酶。但进一步的序列分析显示,该酶N端大约100个氨基酸与数据库中的现有序列没有任何同源性,功能未知。在本文中,我们重点研究了纤维堆囊菌木聚糖酶XvnB N端结构域的功能。通过生物信息学方法对木聚糖酶XynB进行了保守结构域预测,结果显示XynB中氨基酸114-398为糖基水解酶家族10保守区,氨基酸1-113功能未知。在此基础上,我们成功构建了木聚糖酶XynB N端结构域、C端结构域和完整XynB的异源表达质粒,并在大肠杆菌中实现了异源表达。通过亲和层析和凝胶过滤层析,分离纯化了XynB C端结构域的重组蛋白GST-C和XynB的重组蛋白15b-XynB。其中15b-XynB表达形成包涵体,随后对其进行了复性,获得了有活性的木聚糖酶。接下来,我们对15b-XynB与GST-C在酶活力、Km值、最适反应温度和最适反应pH值等方面进行了比较分析。结果表明,二者在上述酶学性质方面没有明显差异。因此,我们推测,XynB N端结构域的缺失对XynB与底物的结合能力和降解木聚糖的能力没有显著的影响,XvnB的N端结构域不具有底物结合区等与木聚糖降解有关的功能。随后,我们又比较了15b-C和15b-XynB在其异源表达菌株中与细胞膜的结合能力。结果显示,15b-XynB可以与细胞膜结合,而15b-C不能与细胞膜结合。因此,我们推测,XynB N端结构域的缺失使蛋白丧失了与细胞膜结合的能力,XvnB N端结构域与XynB在细胞中的定位有关。这为更加深入地研究XynB N端结构域功能打下基础。二、四种人源肝脏蛋白的异源表达、纯化和结晶本文的第二部分研究内容是四种人源肝脏蛋白的异源表达、纯化和结晶,是人类肝脏结构基因组计划中的一部分。人类肝脏结构基因组计划旨在通过实验方式（X-射线晶体衍射、核磁共振质谱）或计算方式（Homology Modeling）,对肝脏中一些具有重要生物学意义的生物大分子（特别是蛋白质分子）的三维结构进行规模化测定。在参加人类肝脏结构基因组研究工作的一年中,主要参与了80多个基因的克隆、表达和纯化筛选工作,从中获得了一定数量的目的蛋白纯品。对其中GA3、GA8、GA17、GA19四个蛋白进行了结晶条件摸索并获得微晶,为相关工作的深入开展奠定了基础。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明及缩写词
• 第一部分 纤维堆囊菌So9733-1木聚糖酶XynB结构域功能研究
• 第一章 文献综述
• 1.1.1 粘细菌简介
• 1.1.1.1 粘细菌的特点与分类:
• 1.1.1.2 纤维堆囊菌的特点
• 1.1.2 木聚糖酶研究进展
• 1.1.2.1 木聚糖的结构
• 1.1.2.2 木聚糖水解酶
• 1.1.2.3 木聚糖酶的理化特点
• 1.1.2.4 木聚糖酶的分类
• 1.1.2.5 木聚糖酶的结构域
• 1.1.2.6 木聚糖酶基因的克隆和异源表达研究进展
• 1.1.2.7 木聚糖酶的应用
• 1.1.3 本实验研究思路
• 第二章 So9733-1木聚糖酶XynB及其N端、C端结构域的异源表达与纯化
• 1.2.1 实验材料
• 1.2.1.1 菌株及质粒
• 1.2.1.2 培养基
• 1.2.1.3 主要仪器与试剂
• 1.2.2 实验方法
• 1.2.2.1 木聚糖酶XynB序列分析
• 1.2.2.2 异源表达质粒的构建
• 1.2.2.3 目的蛋白的诱导表达及表达状态检测
• 1.2.2.4 目的蛋白的纯化
• 1.2.3 实验结果与讨论
• 1.2.3.1 木聚糖酶XynB序列分析
• 1.2.3.2 表达质粒的构建
• 1.2.3.3 目的蛋白的表达状态检测
• 1.2.3.4 15b-C、15b-XynB的纯化与复性
• 1.2.3.5 GST-N的纯化
• 1.2.3.6 GST-C的纯化
• 1.2.3.7 GST-XynB的纯化
• 1.2.4 本章小结
• 第三章 So9733-1木聚糖酶N端结构域功能研究
• 1.3.1 实验材料
• 1.3.1.1 菌株及质粒
• 1.3.1.2 培养基
• 1.3.1.3 主要仪器与试剂
• 1.3.2 实验方法
• 1.3.2.1 酶反应动力常数Km值测定
• 1.3.2.2 木聚糖酶最适pH值的测定
• 1.3.2.3 温度对木聚糖酶水解反应的影响
• 1.3.2.4 15b-C和15b-XynB异源表达菌株的细胞膜的提取
• 1.3.3 实验结果
• 1.3.3.1 木聚糖酶XynB与其C端结构域的酶活力比较
• 1.3.3.2 木聚糖酶XynB与其C端结构域的Km值测定
• 1.3.3.3 温度pH值对木聚糖酶XynB和其C端结构域酶活性的影响
• 1.3.3.4 15b-C和15b-XynB在其异源表达菌株中与细胞膜的结合能力
• 1.3.4 本章小结
• 总结与展望
• 第二部分 四种人源肝脏蛋白的异源表达、纯化和结晶
• 第一章 文献综述
• 2.1.1 结构基因组研究
• 2.1.2 蛋白质晶体学研究
• 2.1.2.1 蛋白质晶体制备的基本过程
• 第二章 四种人源肝脏中蛋白的异源表达、纯化和结晶
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 菌株及质粒
• 2.2.1.2 培养基
• 2.2.1.3 主要仪器和试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 异源表达质粒的构建
• 2.2.2.2 目的蛋白的诱导表达与纯化
• 2.2.2.3 结晶条件的搜索
• 2.2.3 实验结果
• 2.2.3.1 GA3的纯化与结晶条件筛选
• 2.2.3.2 GA8的纯化与结晶条件筛选
• 2.2.3.3 GA17的纯化与结晶条件筛选
• 2.2.3.4 GA19的纯化与结晶条件筛选
• 2.2.4 本章小结
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表