首页> 正文

抑瘤基因NGX6启动子的克隆及初步功能研究

2020-12-02阅读(573)

抑瘤基因NGX6启动子的克隆及初步功能研究

论文摘要

研究背景NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室采用定位侯选克隆策略克隆的一个侯选抑瘤基因（基因登陆号:AF188239）,定位于染色体9p13.3区域。开放阅读框编码的338个氨基酸,分子量为37kDa,具有两个跨膜结构域。胞外区含有一个EGF-like domain,3个N-糖基化位点。胞内区较短,含有一个酪氨酸激酶磷酸化位点。研究表明,NGX6基因在鼻咽癌和结直肠癌中表达明显下降。前期研究发现NGX6基因能够延缓细胞周期的进程;抑制肿瘤增殖和种植瘤的生长;并能抑制肿瘤血管的生成;降低肿瘤细胞体外侵袭能力,同时恢复肿瘤细胞间隙通讯;并通过抑制核内β-catenin的表达负调控Wnt/β-catenin通路;负调控SPAK/JNK通路并抑制P-JNK核移位;下调EGFR-PKC-IKK-NF-κB通路的关键分子和转录因子;下调Ezrin下游与侵袭相关的通路中信号分子的表达。研究证实,NGX6蛋白的EGF样结构域和胞内区是其调控细胞黏附的重要功能域,胞内区是其调节运动迁移的关键结构域。这些功能研究结果高度提示NGX6在可能肿瘤的发生、发展中发挥一定作用,且与肿瘤的侵袭转移相关。本课题在前期工作的基础上,研究了NGX6基因的上游分子事件即转录调控研究,希望从调控该基因表达的上游基因的角度,明确该基因具体的表达调控机制,以进一步揭示NGX6基因在肿瘤的增殖、侵袭、转移中的分子机制,深入阐明NGX6基因的生物学功能。生物信息学分析NGX6基因转录调控区域首先应用生物信息学方法对NGX6基因5′侧翼区序列进行分析。在线软件PromoterInspector的预测结果显示NGX6基因的调控区-157/+91的区间为其候选启动子区,而在线程序FirstEF分析结果表明-257/+407的区间为NGX6的候选启动子区。运用软件CpGplot和CpGFinder在线扫描NGX6基因的5′侧翼区序列,分别发现其5′上游-107/+299或-21/+310的区间存在一个CpG岛。这两个软件的预测结果大部分重叠,且与NGX6基因候选启动子区域重叠。而TSSW和TRED预测NGX6基因的可能存在多个转录起始位点,这种情况在GC富集启动子区中是常见的,位于-50/+50区间。在线软件MatInspector和TFSEARCH的分析结果显示:NGX6基因启动子区为一个不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区。它含有多种转录因子结合位点,其中较重要的结合位点有:Sp1、Egr-1、RREB、P53、MYC-MAX和AP2等。NGX6基因启动子的克隆及鉴定以正常人外周血细胞基因组DNA为模板,利用PCR技术,获得了NGX6基因调控区长片段-357/+769,并通过荧光素酶活性检测系统证实该区域具有与病毒SV40启动子同等强度的启动活性。接着以该长片段为模板,依据转录因子结合位点预测结果,构建了一系列的缺失突变体报告质粒,定位了NGX6基因的近距离启动子为-159/+276区域。而同时采用绿色荧光蛋白活体检测法进一步验证了-159/+276区域的启动子活性。转录因子Sp1对NGX6基因表达的影响真核基因表达调控体系中最关键的是转录起始水平的调控,其基本机制主要包括顺式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶三者之间的相互协同作用,其实质是蛋白质与DNA、蛋白质与蛋白质之间的相互作用。在线软件MatInspector和TFSEARCH分析NGX6基因的近距离启动子区,发现该区域中以转录因子Sp1的结合位点最多,且Threshold值较高。转录因子Sp1结合位点的特异性竞争剂光辉酶素A（Mithramycin A）可大幅度地抑制NGX6启动子活性,并明显下调NGX6基因内源性mRNA表达水平。总之,我们成功获得了NGX6的启动子区域,并确定了其近距离启动子区域。NGX6基因启动子区域是一个不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区,且该调控区内存在一个CpG岛。初步发现转录因子Sp1的抑制剂mithramycin A能够明显地抑制NGX6启动子地活性和NGX6基因的表达。对NGX6基因调控区的CpG岛甲基化的探讨以及其他的顺式作用元件和反式作用因子对NGX6基因表达的调控的研究将是我们下一步的研究目标,以期待能更好的了解NGX6基因在肿瘤发生、发展中的作用和地位,并寻找新的针对鼻咽癌或结直肠癌相关基因转录调控失调的药物提供一个基础平台。

论文目录

  • 一、中文摘要
  • 二、英文摘要
  • 三、目录
  • 四、英文缩略词表
  • 五、论文正文
  • 前言
  • NGX6基因的克隆及生物信息学特征
  • NGX6基因在肿瘤组织及细胞中的表达和定位
  • NGX6基因对肿瘤细胞生物学行为的影响
  • NGX6基因的中游分子事件
  • NGX6基因的下游分子事件
  • 技术路线
  • 第一章 材料与方法
  • 1 材料
  • 1.1 细胞
  • 1.2 菌株和载体
  • 1.3 试剂
  • 1.4 试剂盒
  • 1.5 PCR引物
  • 1.6 主要仪器
  • 2 方法
  • 2.1 生物信息学分析
  • 2.1.1 NGX6基因候选启动子区的生物信息学分析
  • 2.1.2 NGX6基因转录起始位点的生物信息学分析
  • 2.1.3 NGX6基因调控区转录因子结合位点的生物信息学分析
  • 2.1.4 NGX6基因5'上游调控区CpG岛的生物信息学分析
  • 2.2 RT-PCR检测NGX6在各细胞系中的表达
  • 2.2.1 细胞总RNA的抽提
  • 2.2.2 差异RT-PCR
  • 2.3 人外周血细胞gDNA提取及NGX6基因候选启动子区域的扩增
  • 2.3.1 人外周血细胞gDNA提取
  • 2.3.2 PCR扩增NGX6基因候选启动子区域
  • 2.3.3 胶回收PCR产物
  • 2.4 荧光素酶报告基因重组体构建
  • 2.4.1 亚克隆目的片段至T-A载体
  • 2.4.2 双酶切载体pGL3/Enhancer和目的片段
  • 2.4.3 胶回收酶切产物
  • 2.4.4 以T4 DINA ligase连接NGX6/I126及pGL3/enhancer载体
  • 2.4.5 连接产物的转化
  • 2.4.6 挑选克隆,提取质粒
  • 2.4.7 双酶切鉴定及DNA测序鉴定
  • 2.5 缺失突变体荧光素酶报告质粒的构建
  • 2.6 绿色荧光蛋白报告质粒的构建
  • 2.6.1 PCR扩增EGFP
  • 2.6.2 pGL3/Enhancer/EGFP、pGL3/Control/EGFP以及pGL3/-159/+276/EGFP的构建
  • 2.7 基因瞬时转染
  • 2.8 荧光素酶报告基因分析法检测启动子活性
  • 2.8.1 荧光素酶活性检测
  • 2.8.2 β-半乳糖苷酶活性检测
  • 2.8.3 荧光素酶活性相对值处理及其数据分析
  • 2.9 统计学分析
  • 2.10 Mithramycin A处理
  • 2.11 RT-PCR以及灰度扫描
  • 第二章 结果
  • 1 RT-PCR检测NGX6基因在多种细胞中的表达
  • 2 生物信息学方法分析NGX6基因调控区的结构特征
  • 2.1 NGX6基因启动子区的生物信息学预测结果
  • 2.2 NGX6基因启动子区的CpG岛预测结果
  • 2.3 NGX6基因转录起始位点的生物信息学预测结果
  • 2.4 NGX6基因调控区转录因子结合位点的生物信息学预测结果
  • 3 PCR扩增NGX6基因调控序列并构建pGL3/Enhancer/1126重组体
  • 3.1 NGX6基因调控区的扩增并亚克隆至pGEM-T easy
  • 3.2 pGL3/Enhancer/1126重组报告基因载体的构建
  • 4 NGX6基因调控序列（-357/+769）的启动子活性的确定
  • 5 克隆和鉴定NGX6基因近距离启动子
  • 6 绿色荧光蛋白报告质粒验证NGX6基因近距离启动子活性
  • 7 光辉霉素A（Mithramycin A）抑制NGX6基因启动子活性和内源性表达
  • 第三章 讨论
  • 六、结论
  • 七、参考文献
  • 八、综述
  • 九、致谢
  • 十、攻读学位期间主要的研究成果

    • 相关论文文献

    • [1].NGX6基因联合顺铂治疗肺癌的体内外研究[J]. 中国生化药物杂志 2015(05)
    • [2].肝细胞癌中NGX6表达与超声造影特征的关系[J]. 中国肿瘤临床 2008(21)
    • [3].NGX6基因在肝细胞癌中的表达及意义[J]. 中南大学学报(医学版) 2008(10)
    • [4].NGX6基因两转录本在不同分期结直肠癌中的表达及与癌胚抗原的关系(英文)[J]. 中南大学学报(医学版) 2010(05)
    • [5].抑瘤基因NGX6启动子的克隆与功能鉴定[J]. 生物化学与生物物理进展 2010(10)
    • [6].NGX6基因在结直肠癌中的表达及其与微卫星不稳定的关系[J]. 结直肠肛门外科 2012(01)
    • [7].NGX6、TUSC4基因与大肠癌的发生发展研究进展[J]. 实用医院临床杂志 2012(05)
    • [8].结肠癌中NGX6抑制EGFR/K-ras/JNK/c-Jun/cyclin D1信号通路的研究[J]. 生物化学与生物物理进展 2008(05)
    • [9].NGX6、p21WAF1在结直肠癌中的表达及意义[J]. 现代实用医学 2012(07)
    • [10].抑瘤基因NGX6对结肠癌血管形成的影响[J]. 世界华人消化杂志 2009(25)
    • [11].NGX6基因联用5-Fu对人结肠癌细胞凋亡的影响[J]. 中国肿瘤临床 2009(21)
    • [12].抑瘤基因NGX6对人结肠癌细胞凋亡的影响[J]. 生物化学与生物物理进展 2008(10)
    • [13].胃癌组织NGX6和Cyclin D1表达及其生物学意义的探讨[J]. 中华肿瘤防治杂志 2012(08)
    • [14].BRD7、NGX6基因在急性白血病中的表达[J]. 肿瘤防治研究 2008(09)
    • [15].NGX6与IL-17F在大肠癌及大肠腺瘤中的表达及其与VEGF的相关性分析[J]. 癌症进展 2018(06)
    • [16].NGX6和CyclinD1蛋白在食管鳞癌组织中的表达及意义[J]. 中国癌症杂志 2010(12)
    • [17].NGX6转染鼻咽癌细胞对表达血管内皮生长因子-C的影响[J]. 医学研究生学报 2010(07)

    标签：;  ;  ;  

    抑瘤基因NGX6启动子的克隆及初步功能研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5