柿子单宁关键级分的解蛇毒活性研究及其结构表征

论文摘要

为了深入研究柿子单宁的解蛇毒活性及其构效关系,本研究采用无水乙醇为提取溶剂,并采用超声波辅助法提取柿子果肉中的单宁,通过单因素和正交试验对提取工艺进行优化；通过体外研究单宁对江浙蝮蛇、尖吻蝮蛇和眼镜蛇蛇毒蛋白酶活的影响以及体内对染毒小鼠的致死毒性、出血毒性、肌肉毒性和神经毒性的解毒效果,探究了柿子单宁关键级分的解蛇毒作用；借助于HPLC. MADLI-TOF/MS、红外、圆二色谱等技术鉴定出了解蛇毒关键级分的聚合度和结构单元组成；进一步研究了柿子单宁酸降解副产物的结构特点；初步探讨了柿子单宁结构与其活性的关系。主要研究结果如下：1.超声波辅助法提取柿子单宁的研究以缩合单宁为主要指标,选定提取柿子单宁的最优组合为提取时间30min、提取温度60℃、超声波功率80W、料液比1：8。在此条件下得到的总酚提取量为24.36 mg/g,缩合单宁提取量为15.23mg/g,达到了最佳的提取量。柿子单宁粗提物分别经过AB-8大孔树脂和Toyopearl HW 50F凝胶树脂纯化分级后,得到PT20、PT40和PT60三个级分。2.柿子单宁关键级分的体内外解毒实验（1）当三种蛇毒与不同聚合度的柿子单宁以不同的质量比混合时,随着单宁含量的增加,蛇毒中的蛋白质水解酶、L-氨基酸氧化酶、磷脂酶A2、精氨酸酯酶和乙酰胆碱酯酶都受到了很大程度的抑制,且呈明显的剂量效应关系,同时抑制效果随单宁聚合度增加而增强。当单宁分子量增加到一定的程度后,单宁对酶蛋白抑制程度受单宁分子量影响不大。（2）单宁关键级分PT40对染蛇毒小鼠的死亡时间有显著的延迟作用,存活率也得到了一定程度的提高,对于江浙腹蛇、尖吻腹蛇、眼镜蛇而言,给药高剂量组小鼠存活率分别可达到60%、70%、40%。（3）单宁关键级分PT40对江浙蝮蛇蛇毒所致小鼠的出血毒性有显著的抑制作用,其中低、中、高剂量的出血面积抑制率分别为31.4%、63.3%和95.6%,呈明显的剂量效应关系。（4）单宁关键级分PT40对眼镜蛇蛇毒所致小鼠的肌肉毒性有显著的抑制作用,其中对蛇毒所引起的CK酶活力上升有显著的抑制作用（P<0.01）,低、中、高剂量的PT40对CK酶活抑制率分别为14.5%、26.1%和42%,呈明显的剂量效应关系。从小鼠EDL肌肉组织切片中也可以看出,蛇毒组小鼠大面积肌纤维坏死,炎症细胞较多。给药组相应损伤有一定程度的减弱,但是并未能完全抑制蛇毒造成的损伤,且损伤程度呈现剂量效应关系。（5）PT40对眼镜蛇蛇毒所致小鼠的神经毒性有一定的抑制作用,通过旷场分析实验发现,与模型组比较,低、中、高剂量的PT40对小鼠的自主活动次数都有显著的提高,呈明显的剂量效应关系。在水迷宫的测试中,给药组均能延长潜伏期,但没有达到显著效果。从小鼠的小脑组织切片中也可以看出,蛇毒组小鼠浦金野细胞呈现不同程度的肿胀变圆,伴有空泡,给药组相应症状得到不同程度的减轻,且呈剂量效应关系,提示PT40对由蛇毒所致小鼠神经毒性有一定程度的改善作用。3.PT40结构表征（1）通过HPLC-硫解法和MALDI-TOF MS法对柿子单宁的结构进行了初步的研究,表明柿子单宁具有以下不同于其它来源缩合单宁的独特结构：①末端基团为C和EGCG;②延伸端结构为EGC, EGCG, EC和ECG,较其它来源的缩合单宁有更大的异质性；③同时发现分子中桔酰化程度高达90%,存在A型连接。（2）红外吸收光谱图在1707cm-1处的吸收是由于单宁中C=O伸缩振动；同时在1000-1650cm-1和700-850 cm-1区域具有原花青素的特征骨架振动吸收峰,1534 cm-1处有一较宽单峰,属于B环伸缩振动吸收；在726和763 cm-1处的吸收属B环C—H面外弯曲振动；由此证明柿子单宁是原翠雀定-原花青定混合物。（3）圆二色谱研究发现PT40在220～240nm有正cotton效应峰,则可以判断其C4位为4p构型。4.柿子单宁含量的测定方法（1）不同的测定方法和不同的标准品对柿子中缩合单宁的含量的测定有很大影响。同时对正丁醇-盐酸法做了改进,以15%的盐酸作为酸性介质,5%的硫酸铁铵溶液作为催化剂,在反应体系不含水的条件下反应30min。但即使在优化的条件下,柿子单宁在正丁醇-盐酸体系中的颜色反应仍然很低,有关柿子单宁准确测定方法还有待进一步研究。（2）PT40酸降解副产物的结构进行了初步研究,通过FT-IR和HPLC-MS分析,初步推断该副产物C-3取代基团为乙基。

论文目录

• 缩略语表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 国内外关于植物单宁的研究进展
• 1.1 植物单宁的制备
• 1.1.1 植物单宁的提取
• 1.1.1.1 传统水浴-溶剂提取法
• 1.1.1.2 仪器辅助提取法
• 1.1.1.3 酶转化提取
• 1.1.2 植物单宁的分离纯化方法
• 1.1.2.1 色谱分离法
• 1.1.2.2 超过滤法
• 1.1.2.3 高速逆流色谱法（HSCCC）
• 1.2 植物单宁的结构表征
• 1.2.1 纸色谱法（PC）
• 1.2.2 薄层色谱法（TLC）
• 1.2.3 高效液相色谱法分析鉴定（HPLC）
• 1.2.4 其它分析检测技术
• 1.3 植物单宁的各种生理活性
• 1.3.1 抗氧化活性和清除自由基作用
• 1.3.2 保护心血管作用
• 1.3.3 抑菌和抗病毒作用
• 1.3.4 抗肿瘤和促进免疫
• 1.3.5 解蛇毒活性
• 2 研究目的、意义和内容
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 研究内容
• 第二章 超声波辅助法提取柿子单宁的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 化学试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 柿子单宁的制备
• 1.4.2 标准曲线的制作
• 1.4.3 提取条件的单因素试验
• 1.4.4 正交试验的设计方案
• 1.4.5 提取次数的确定
• 1.4.6 对照试验
• 1.4.7 高效液相色谱条件的确定
• 2 结果与分析
• 2.1 单因素试验结果
• 2.1.1 料液比的影响
• 2.1.2 提取温度的影响
• 2.1.3 超声时间的影响
• 2.1.4 超声波功率的影响
• 2.2 正交实验结果
• 2.4 提取次数的确定
• 2.5 对照实验结果
• 2.6 高效液相色谱分析
• 3 讨论
• 第三章 柿子单宁关键级分的体内外解蛇毒作用研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与仪器设备
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 材料与设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 采用不同树脂对柿子单宁粗提物分级效果的比较
• 1.2.1.1 X型大孔树脂
• 1.2.1.2 HP型大孔树脂
• 1.2.1.3 Toyopearl HW-50F凝胶色谱柱
• 1.2.1.4 柿子单宁各级分的HPLC分析
• 1.2.2 柿子单宁的体外解毒实验
• 1.2.2.1 蛋白质水解酶活力的测定
• 1.2.2.2 L-氨基酸氧化酶活力的测定
• 2酶活力的测定'>1.2.2.3 磷脂酶A₂酶活力的测定
• 1.2.2.4 精氨酸酯酶活力的测定
• 1.2.2.5 乙酰胆碱酯酶活力的测定
• 1.2.2.6 蛇毒与单宁作用后的SDS-PAGE分析
• 1.2.2.7 蛇毒蛋白质印迹分析（转膜）
• 1.2.3 柿子单宁的体内解毒实验
• 1.2.3.1 柿子单宁及各种蛇毒的半数致死剂量
• 1.2.3.2 单宁对三种蛇毒所致小鼠的体内解毒作用
• 1.2.3.3 柿子单宁对江浙蝮蛇所致小鼠出血毒性的影响
• 1.2.3.4 柿子单宁对眼镜蛇毒所致小鼠的肌肉毒性的影响
• 1.2.3.5 柿子单宁对眼镜蛇毒所致小鼠的神经毒性的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 不同树脂对柿子单宁粗提物分级级分的HPLC分析
• 2.1.1 X型大孔树脂得到各级分样品
• 2.1.2 HP型大孔树脂得到各级分样品
• 2.1.3 Toyopearl HW-50F凝胶树脂得到各级分样品
• 2.2 Toyo不同级分柿子单宁的体外解毒实验效果比较
• 2.2.1 单宁对蛇毒中蛋白质水解酶的影响
• 2.2.2 单宁对蛇毒中L-氨基酸氧化酶活力的影响
• 2酶活力的影响'>2.2.3 单宁对蛇毒中磷脂酶A₂酶活力的影响
• 2.2.4 单宁对蛇毒中乙酰胆碱酯酶活力的影响
• 2.2.5 单宁对蛇毒中精氨酸酯酶活力的影响
• 2.2.6 单宁与蛇毒蛋白质结合后的SDS-PAGE图
• 2.2.7 单宁与蛇毒蛋白质结合后的蛋白质印迹分析
• 2.3 PT40的体内解蛇毒效果
• 2.3.1 柿子单宁及各种蛇毒的半数致死剂量
• 2.3.1.1 江浙蝮蛇的半数致死剂量
• 2.3.1.2 尖吻蝮蛇的半数致死剂量
• 2.3.1.3 眼镜蛇的半数致死剂量
• 2.3.2 PT40对三种蛇毒所致小鼠的致死毒性的解毒作用
• 2.3.3 PT40对江浙蝮蛇所致小鼠出血毒性的影响
• 2.3.4 PT40对眼镜蛇蛇毒所致小鼠肌肉毒性的影响
• 2.3.4.1 柿子单宁对眼镜蛇染毒小鼠血清中CK酶活力的影响
• 2.3.4.2 肌肉组织切片观察
• 2.3.5 PT40对眼镜蛇蛇毒所致小鼠神经毒性的影响
• 2.3.5.1 旷场分析实验
• 2.3.5.2 水迷宫实验
• 2.3.5.3 小脑组织病理学检查
• 3 讨论
• 第四章 PT40结构表征
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 PT40的硫解反应
• 1.4.2 PT40正丁醇-盐酸降解反应
• 1.4.3 PT40的MADLI-TOF/MS分析
• 1.4.4 PT40的红外分析
• 1.4.5 PT40的圆二色谱分析
• 2 结果与分析
• 2.1 PT40的硫解反应
• 2.2 PT40的正丁醇-盐酸降解反应
• 2.2.1 降解产物的HPLC分析
• 2.2.2 PT40的MADLI-TOF/MS分析
• 2.2.3 PT40红外光谱分析
• 2.2.4 PT40的圆二光色谱（CD）分析
• 3 讨论
• 第五章 柿子单宁含量测定方法的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料和仪器设备
• 1.1.1 实验原料
• 1.1.2 实验试剂
• 1.1.3 仪器与设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 不同方法的比较
• 1.2.1.1 甲醛沉淀原花青素法
• 1.2.1.2 直接紫外分光光度法
• 1.2.1.3 香草醛-盐酸法
• 1.2.1.4 正丁醇-盐酸法
• 1.2.1.5 香草醛-硫酸法
• 1.2.2 正丁醇-盐酸法反应条件的选择
• 1.2.2.1 不同含水量
• 1.2.2.2 不同盐酸浓度
• 1.2.2.3 不同铁盐浓度
• 1.2.2.4 不同反应时间
• 1.2.2.5 不同标准品的比较
• 1.2.3 盐酸降解副产物的制备与结构分析
• 1.2.3.1 副产物的制备
• 1.2.3.2 副产物的FT-IR分析
• 1.2.3.3 副产物的HPLC分析
• 1.2.3.4 副产物的HPLC-MS分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同方法的比较
• 2.2 正丁醇-盐酸法测定柿子单宁条件的优化
• 2.2.1 不同含水量的影响
• 2.2.2 不同盐酸浓度的影响
• 2.2.3 不同硫酸铁铵浓度的影响
• 2.2.4 不同反应时间的影响
• 2.2.5 不同标准品对测定结果的影响
• 2.3 PT40正丁醇降解副产物的结构初探
• 2.3.1 PT40正丁醇降解产物的紫外扫描图
• 2.3.2 副产物的FT-IR分析
• 2.3.3 副产物的HPLC-DAD分析
• 2.3.4 副产物的HPLC-MS分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录（硕士期间发表的论文）